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ICS67.080B31广东省质量技术监督局备案号：376—2006广东省东莞市农业地方标准DB441900/T06—2006东莞香蕉脱毒组培苗质量标准2006-05-10发布2006-09-01实施广东省东莞市质量技术监督局发布DB441900DB441900/T06—2006前言香蕉组培技术自八十年代获得成功后，由于该技术能保证种质纯正，与传统的吸芽繁殖相比，通过组培苗繁殖具有生长迅速，长势整齐一致，便于生产管理，缩短采收期，病害少，产量增加30%～50%等优点，因而深受广大蕉农的欢迎。但因缺乏一个统一的标准，市场上香蕉脱毒组培苗质量参差不齐，影响了香蕉产量，为确保香蕉脱毒组培苗的质量,规范香蕉脱毒苗市场，特制定本标准。本标准的附录A、附录B、附录C、附录D均为资料性附录。本标准由东莞市农业局提出并归口。本标准起草单位为东莞市生物技术研究所。本标准起草人为：郑健临、陈春满、王方正、王晓宁等。本标准首次发布日期：2006年5月10日。DB441900/T06—20061东莞香蕉脱毒组培苗质量标准1范围本标准的“香蕉”指栽培上广义的“香蕉”，即香芽蕉（亦简称香蕉）、粉蕉、龙牙蕉和大蕉四大类中的香芽蕉。本标准规定了香蕉脱毒苗的定义、分类和分级、质量要求、检验规则和包装、标志、运输与贮存。本标准适用于通过组织培养技术培育不带香蕉花叶心腐病（CMV）和束顶病（BBTV）病毒香蕉脱毒苗的生产。2术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2.1脱毒组培瓶苗指通过组织培养技术繁育，并经病毒检测后不带有花叶心腐病和束顶病病毒，在培养瓶中生长且已达假植标准的根、茎、叶俱全的完整香蕉小植株。2.2营养袋（杯）苗香蕉脱毒组培瓶苗分级假植于装有营养土的特定规格营养袋（杯）中，在隔离良好的条件下经精心管理所培育而成的、可出圃供大田定植的香蕉小植株。2.3变异株指与正常植株相比，株型矮化，叶片短圆；或株型纤弱，叶片较细、长，叶面不规则凹凸，叶片扭曲；或叶片部分缺绿呈花叶状等主要特征表现异常的植株。2.4变异率指生产不正常的植株数和总植株的比率。2.5带毒率指经病毒检测后带病毒的植株数占所检植株总数的百分比。DB441900/T06—200623分类和标记3.1脱毒苗按繁育过程分为香蕉组培瓶苗和营养袋（杯）苗两类。3.2香蕉组培瓶苗按质量要求分为一级、二级和三级三个级别；营养袋（杯）苗按质量要求分为一级、二级和三级三个级别。4质量要求4.1香蕉组培瓶苗的质量要求见表1。表1瓶苗的质量要求4.2营养杯苗的质量要求见表2。表2营养杯苗的质量要求指标项目一级二级三级假茎高，cm≥4025～4015～25假茎粗，cm≥1.81.2～1.80.6～1.2叶片数13～157～134～6叶色正常变异率，%≤2.02.0～3.03.1～5.0带毒率0品种纯度，%≥99≥96≥955试验方法5.1病毒检测方法5.1.1抗原的制备对照上清的准备：采集香蕉病叶1.0g，加入液体氮冷冻研磨成粉末，加入5.0mL研磨缓冲液，转入10mL离心管，12000rpm，离心5min，取上清。将得到的上清用做抗原和阳性对照。待检测香蕉植株上清的准备：采集需检测香蕉植株的叶片，采用相同方法得到上清，取上清检测待用。5.1.2抗血清的置备鉴定病毒的置备（自己提纯病毒，要求纯度达到95%）：取1.2ug提纯病毒加入10mL福氏不完全佐剂（无水羊毛脂和液体石蜡之比为1︰4）进行完全乳指标项目一级二级三级假茎高，cm4.0～4.93.0～3.9≤3.0假茎粗，cm0.30～0.390.25～0.290.25叶片数≥43～4≤3假茎基部颜色绿色或浅绿色绿色或浅绿色绿色或浅绿色变异率，%≤2.02.1～3.03.1～5带毒率0品种纯度，%≥99≥98≥96DB441900/T06—20063化，所得就是抗原，置-20℃保存备用。免疫程序：免疫前对家兔采用耳静脉取血，作为ELISA反应时的阴性对照血清；随后免疫家兔。第一次取2mL乳化抗原（含300ug抗原CP），采用背部多点皮下注射的方法免疫家兔；第一次注射后7d，采用同样的方法和剂量第二次免疫家兔；第二次注射后7d，采用同样的方法和剂量第三次免疫家兔；第三次注射后7d，采用同样的方法和剂量，加强免疫一次；最后一次注射后10d，采用颈动脉采血，收集血液；4℃血液处理及保存将采集的血液于室温放置60min，然后于4℃过夜；将析出的血清取出，于室温4000rpm，离心10min，取上清，加入等体积的甘油，混均后分装；密封，配-20℃保存，这就是抗血清。5.1.3检测取置备的抗原200uL，加入到酶联板，37℃放置2h，倒掉上清液，用力扣干酶联板。然后加入200uL的PBST洗液洗5min，倒掉洗液，用力扣干酶联板，洗板重复三次。加入200uL的封闭液，37℃放置2h。清洗酶联想板，方法同上。加入一抗（抗血清），37℃放置2h。清洗酶联想板，方法同上。加入二抗（辣根过氧化物酶或者碱性磷酸脂）37℃放置2h。清洗酶联想板，方法同上。加入100uL含8mg邻苯二胺、15uL双氧水的低物缓冲液pH5.0，室温黑暗放置10min～20min。每孔滴入一滴2M的H2SO4，以终止反应，观察反应结果。用基础酶标仪测定OD4R2值，进行数据分析。若用肉眼观测分析；CK无色阳性样品现桔黄色。5.2变异株的检出5.2.1变异株的类型5.2.1.1株型变矮，苗矮壮，叶片较短圆、肥厚，叶色特别浓绿，常被误认为壮苗。5.2.1.2株型纤弱，生长慢，叶片较细，直立，部分缺绿呈花叶状，抽蕾迟。5.2.1.3叶面叶沿不规则凹凸，叶片扭曲；或叶片部分缺绿呈花叶状。5.2.2变异株的检出上述变异株往往不能结果或结果不正常，产量低、果型差，商品价值低。因此，在出圃前应不惜剔出以上类型的变异苗，经过全面综合检验后方可出圃，以确保产品质量。5.3检验规则其它项目5.3.1用标准量具测定假茎高、假茎粗、根条数、叶片数。5.3.2通过观察品种主要特征，目测品种纯度、变异率和假茎基部颜色。6检验规则6.1组批同一时间、同一地点取得同一品种不同单株的外植体经组培扩大繁殖后的脱毒苗为一批。6.2检验分类检验分为病毒检验、出厂（圃）检验和型式检验。6.3病毒检验DB441900/T06—20064由省级有关部门核准认定的检测单位执行脱毒原种组培苗、组培瓶苗病毒检测，并出具正规的香蕉脱毒苗病毒检测报告（见附录D）。6.4出厂（圃）检验由厂家的质量检验室执行检验香蕉脱毒组培瓶苗和营养袋（杯）苗的假茎高、茎粗、根条数、叶片数、变异率和品种纯度。并附有香蕉脱毒苗出厂（圃）合格证（见附录C）。6.5型式检验型式检验的项目为本标准质量要求中所规定的所有项目。除苗出圃时需进行检验并附脱毒组培瓶苗和营养袋（杯）苗型式检验记录表（见附录A、附录B），在正常生产时，每年需进行一次。新建厂家和改变工艺程序时要进行型式检验。6.6抽样病毒检验中每一株系的组培第一代都应经过病毒检测，其余抽验量同出厂（圃）检验；出厂（圃）检验随机抽样应不低于出厂（圃）总量的5%～10%，最低数量不少于50株。6.7判定规则未进行病毒检验或型式检验结果脱毒率达不到相应标准即判该批产品不合格，其它指标如有10%以上不合格，应加倍抽样对不合格项目进行复检，若再有10%以上不合格判为该批产品不合格。7标志、包装、运输及贮存7.1包装组培瓶苗用泡沫箱或纸箱包装；袋（杯）装苗用木箱、竹箱、纸箱包装，装箱时及运输途中，袋（杯）中土柱应较硬实，袋（杯）子完整，以防止土柱松散。7.2标志包装箱内附脱毒瓶苗型式检验记录表（附录A）、营养袋（杯）苗型式检验记录表（附录B）出厂（圃）合格证（附录C）、病毒检测报告（附录D）；外面应注明标准号、生产厂家的地址及联系电话。如一车中装两个以上品种，应按品种分别包装并做出明显标志。7.3运输汽车运输或办理托运至指定地点，运输过程中注意保湿、防雨、防冻。7.4贮存组培瓶苗洗出瓶后2d内，隔离快繁种苗出圃后3d内移栽。DB441900/T06—20065附录A（资料性附录）香蕉脱毒组培瓶苗型式检验记录表品种：检测日期：育苗单位：购苗单位：出圃株数：抽检株数：样株号假茎高（cm）假茎粗（cm）叶片数（片）假茎基部颜色白色根数（条）变异率（%）品种纯度（%）初评级别审核人：校准人：检测人：（签字）（签字）（签字）DB441900/T06—20066附录B（资料性附录）香蕉脱毒营养袋（杯）苗型式检验记录表品种：检测日期：育苗单位：购苗单位：出圃株数：抽检株数：样株号假茎高（cm）假茎粗（cm）新出叶数（片）叶色变异率（%）品种纯度（%）初评级别审核人：校准人：检测人：（签字）（签字）（签字）DB441900/T06—20067附录C（资料性附录）香蕉脱毒组培苗出厂（圃）合格证脱毒香蕉组培苗出厂（圃）合格证编号：等级：品种名称：原种采集地：病毒检疫单位：繁殖代数：种苗数量：购苗单位：质检员：生产单位：出厂（圃）日期：DB441900/T06—20068附录D（资料性附录）香蕉原种苗病毒检测报告香蕉原种苗病毒检测报告送样单位：品种名称：原种采集地：送样时间：原种数量：编号：编号黄瓜花叶病毒检测结果注：病毒检测结果“+”表示阳性带互，“-”表示阴性不带毒。病毒检疫单位：质检员：检测日期：（盖章）（盖章）