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SC/T3024—2004SC/T3024—2004无公害食品腹泻性贝类毒素的测定生物法发布时间：2004年1月7日实施时间：2004年3月1日发布单位：中华人民共和国农业部1、范围本标准规定了腹泻性贝类毒素(DSP)的测定方法—生物法。本标准适用于软体动物贝类可食部分中腹泻性贝类毒素(DSP)的测定。2、原理用丙酮提取贝类中毒素，再转移至乙醚中，经减压浓缩蒸干后，再以1％吐温-60生理盐水溶解残留物，注射小鼠，观察存活情况，计算其毒力。3、试剂和材料3.1丙酮(分析纯)。3.2乙醚(分析纯)。3.31％吐温-60生理盐水：称取1.0g吐温-60，溶于生理盐水(0.8％NaCl)中，并定容至100.0mL。4、仪器和设备4.1旋转蒸发器。SC/T3024—20044.2均质器。4.3磨口烧瓶：圆底，500mL、100mL。4.4布氏漏斗：Ф100mm。4.5分液漏斗：具塞，500mL。4.6天平：感量0.1g。4.7刻度试管：10mL，具塞。4.8冰箱：0℃～5℃和－15℃～－20℃。4.9注射器：1mL。4.10注射器针头：8＃。4.11小鼠：体重为16g～20g的健康ICR系雄性小鼠。5、检样的制备5.1生鲜带壳的贝类a)用清水彻底洗净贝类外壳，开壳，用清水淋洗内部去除泥沙及其他外来杂质，仔细取出贝肉，切勿割破肉体；b)收集贝肉，沥水5min，捡出碎壳等杂物，迅速冷冻，贮藏备用；c)注意不要破坏闭壳肌以外的组织，尤其是中肠腺(又称消化盲囊，组织呈暗绿色或褐绿色)。开壳前不能加热或用麻醉剂。5.2冷冻贝类在室温下，使冷冻的样品(带壳或去壳的)呈半冷冻状态，按5.1方法清洗、开壳、淋洗、SC/T3024—2004取肉。5.3取样a)可以切取中肠腺的贝类(扇贝、贻贝、牡蛎等)，称取200g贝肉后，仔细切取全部中肠腺，将中肠腺称重后细切混合作为检样，注意不要使中肠内容物污染案板；b)对于尚未确定部位毒性的贝类及不易切取中肠腺的小型贝肉，可将全部贝肉细切、混合，作为检样；c)为避免毒素的危害，应戴手套进行检验操作，移液管等用过的器材应在5％的次氯酸钠溶液中浸泡1h以上，以使毒素分解；废弃的提取液等也应用5％的次氯酸钠溶液处理。6、提取6.1取5.3a)处理的中肠腺，或5.3b)处理的200g贝肉置于均质杯内，均质2min。6.2加3倍量丙酮，与样品充分搅拌均刀后，用布氏漏斗抽滤并收集提取液。对残渣以检样两倍量丙酮再次抽滤两次，合并抽滤液。6.3将抽提液移人500mL的磨口烧瓶中，减压浓缩(旋转蒸发器，56℃)去除丙酮，直至在液体表面分离出油状物。6.4将浓缩液移入分液漏斗内，以100mL～200mL乙醚和少量的水洗下粘壁部分，轻轻振荡(不能生成乳浊液)，静置分层后，去除水层(下层)，用相当乙醚半量的蒸馏水洗乙醚层两次，再将乙醚层移人250mL的磨口烧瓶中，减压浓缩(旋转蒸发器，35℃)去除乙醚。6.5以少量乙醚将浓缩物移人100mL磨口烧瓶中，再次减压浓缩去SC/T3024—2004除乙醚。6.6以1％吐温－60生理盐水将全部浓缩物在刻度试管中稀释到10mL。此时1mL试液相当于20g去壳贝肉的重量，以此悬浮液作为试验原液。6.7以试验原液注射小鼠，24h内3只均死亡时，需将试验原液进一步稀释，再注射小鼠。稀释前，应先振荡使溶液成均刀悬浮液，再取部分试液以1％吐温－60生理盐水稀释。7、小鼠试验7.1以振荡器使试液或其稀释液成为均刀的悬浮液。7.2将每只小鼠称重，每三只小鼠为一组，分别将1mL试液注射到小鼠腹腔中。7.3同时，另取三只小鼠作为对照组，注射1mLl％吐温－60生理盐水于腹腔中。7.4观察自注射开始到24h后的小鼠存活情况，求出一组三只中死亡两只及两只以上的最小注射量。7.5小鼠注射腹泻性贝毒后的症状为运动不活泼，大多呼吸异常，致死时间长。8、结果计算和表述8.1毒力的计算使体重16g～20g的小鼠在24h死亡的毒力为1个小鼠单位(MU)。样品中DSP毒力的计算，按表1选择24h内死亡两只及两只以上鼠的最小注射量及最大稀释倍数进行计算。SC/T3024—20048.2注射量与毒力的关系注射量与毒力的关系见表1。表1注射量与毒力的关系试验液注射量mL检样量ag毒力MU/g原液原液2倍稀释液2倍稀释液4倍稀释液4倍稀释液8倍稀释液8倍稀释液16倍稀释液16倍稀释液1.00.51.00.51.00.51.00.51.00.5201010552.52.51.251.250.6250.050.10.10.20.20.40.40.80.81.6a以中肠腺为检样时，相当于含有中肠腺的去壳贝肉量。SC/T3024—2004附录A(资料性附录)本标准与日本厚生省标准的技术差异及原因表A．1为本标准与日本厚生省标准的技术差异及原因一览表。表A．1本标准与日本厚生省标准的技术差异及原因本标准的章条技术性差异原因封面、前言、标准的全文原方法标准的格式与此完全不同标准格式采用GB/T1.1－2000的规定5章～9章文字叙述中有部分改动，将原文中的大段文字修改为逐条叙述按GB/T1.1－2000的要求，将标准条文细化，使其更有逻辑性、更有条理，使用便捷6.7原标准为“必要时，对试验溶液可做进一步稀释”，现改为“以试验原液注射鼠时，24h内3只均死亡时，需将试验原液进一步稀释，再注射鼠”更清楚说明需要稀释时的情况，便于试验时的操作