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（二）基因工程的基本原理1.基因工程常用的酶有：解，聚，连，切酶（1）DNA解链酶（2）DNA聚合酶（3）DNA连接酶（4）限制性核酸内切酶最重要的工具酶为：连接酶和限制性核酸内切酶（DNA序列特异性内切酶，而非RNA序列特异性内切酶）2.基因工程原理（1）目的基因获取：多种途径获取，其中较重要的方法为PCR聚合酶链反应：是已知序列信息情况下，获得目的基因最方便的方法在临床或科研中最流行。其催化酶为TaqDNA聚合酶：为水生菌YT-1菌株的DNA聚合酶（2）克隆载体的选择原则——自复分小两遗传，多克隆位点为必备1）自复：能自主复制2）分小：分子量小，以容纳较大的外源DNA3）两遗传：具有两个以上的遗传标记物：便于重组体的筛选和鉴定4）多克隆位点为必备：有外源DNA的插入点，具有多个单一酶切位点（3）外源基因和载体连接：1）定义：目的基因和载体DNA片段连接需要的拼接酶2）DNA连接酶：DNA技术最重要酶3）实验室常用：T4DNA连接酶4）连接方式：有多种，注意没有粘-平方式为常见的干扰项（4）重组体DNA导入受体菌1）受体菌条件——安全宿主菌；本身限制性内切酶和重组酶缺陷；处于感受态（0～4度下用氯化钙处理增加细胞膜通透性成为感受态细胞）2）导入方式：转化，转染和感染——转化：用于原核细胞，如氯化钙转化法，，——转染：用于真核细胞转染如磷酸钙转染，电穿孔，脂质体转染。。（5）重组体筛选1）直接选择法——抗药性标记选择：是筛选重组体最常用的方法——标志补救：如α互补筛选法2）免疫学方法筛选——适用范围：尤其适宜于筛选无任何选择标志的基因我们已经学了DNA，RNA，蛋白的相关生化知识，小结一下鉴定它们各自的的方法：1.用来鉴定DNA的技术：southern印迹杂交2.用来鉴定RNA的技术：Northern印迹杂交3.用来鉴定蛋白的技术：Western印迹杂交二、基因工程与医学1.疾病相关基因的发现：根据克隆基因的定位和性质研究所提供的线索，可进一步确定克隆的基因在分子遗传病中的作用。因此，一个疾病相关基因的发现不仅可导致新的遗传病的发现，而且对遗传病的诊断和治疗都是极有价值的。2.生物制药：在基因功能、基因克隆研究基础上，构建适当的表达体系表达有生物活性并有药用价值的蛋白质、多肽；再经过科学的动物实验、严格的临床试验和药物审查。发展为新药物。3.DNA诊断：DNA诊断也称基因诊断，目前已发展成为一门独具特色的诊断学科。DNA诊断是利用分子生物学及分子遗传学的技术和原理，在DNA水平分析、鉴定遗传性疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。4.基因治疗——基因矫换增失，不包括基因突变。（1）基因矫正（2）基因置换（3）基因增补（4）基因失活小结1.分子克隆上游技术：基因工程也称基因克隆技术/重组DNA技术。具体过程为：分，切，接，转，筛分-分离目的基因切-限制酶切目的基因和载体接-拼接重组体转-转入受体菌筛-筛选重组体2.分子克隆下游技术——克隆基因的表达：体外表达特点注意：进入细胞内的重组DNA并非都可表达目标蛋白第十四节癌基因与抑癌基因一、癌基因和抑癌基因（一）癌基因的概念1.概念：细胞内控制生长和分化的基因出现异常，体内导致癌变，体外导致细胞转化强调：多个（非一个）癌基因激活才导致癌症的发生。Src为常见的癌基因家族成员之一，表达产物有酪氨酸磷酸化蛋白激酶活性（2）癌基因分类：病毒癌基因和细胞癌基因1）病毒癌基因：主要由逆转录RNA病毒的存在编码的癌基因2）细胞癌基因（又称为原癌基因）：可存于正常细胞中（二）抑癌基因的概念1.概念：抑制癌细胞生长和分化的基因，也可存于正常细胞内。2.作用（1）抑制细胞癌变（2）可诱导细胞程序性死亡（3）失活导致癌症3.常考示例（1）P53：其失活和多种肿瘤发生有关（2）Rb基因：视网膜母细胞瘤基因（看看两个字母象不象两只眼睛分开了?）失活或突变导致视网膜母细胞瘤，是最早发现的肿瘤抑制基因，也是世界上第一个被克隆和完成测序的抑癌基因。二、生长因子1.生长因子基本概念：生长因子是一类调节细胞生长与增殖的多肽类物质。多肽类物质和特异性生长因子受体结合后，调节细胞生长和增殖。2.生长因子作用机制：（1）生长因子作用的靶细胞上存在相应受体。（2）与膜受体结合后，出现的三化情况——重点了解！1）导致酪氨酸激酶活化2）胞内相关蛋白质被磷酸化3）导致核内转录因子活化，调节基因转录第十五节血液生化一、血液的化学成分1.水和无机盐：正常人血液的含水量为77%～81%，比重为1.050～1.060。血液的pH为7.40±0.05。血液的固体成分可分为无机物和有机物两大类。无机物主要以电解质为主，重要的阳离子有Na+、K+、Ca2+、Mg2+，重要的阴离子有Cl-、HCO3-、HPO42-等2.血浆蛋白质：人血浆内蛋白质总浓度大约为70～75g/L，它们是血浆主要的固体成分。3.非蛋白质含氮物质：非蛋白质类含氮化合物主要有尿素、肌酸、肌酸酐、尿酸、胆红素和氨等，它们中的氮总称为非蛋白氮（NPN）。4.不合氮的有机化合物：不含氮的有机物包括糖类、脂类、小分子有机酸等。二、血浆蛋白质1.血浆蛋白质和其他大分子物质的关联：多余蛋白可以转变为糖类和脂肪。2.功能：总体而言蛋白质在维持组织生长、更新和修复上起重要作用，具体生理功能从各自的分类中详细阐述3.血浆蛋白分类（1）醋纤维电泳分：清，球蛋白。1）均朝正级泳动2）速度由快向慢顺序：清蛋白＞α1球蛋白＞α2球蛋白＞β球蛋白＞γ球蛋白来源：金樟教育集团医考事业部