CTC检测技术

1GDS_70000_Title_v11外周血循环肿瘤细胞检测技术第三军医大学西南医院张晓丽接肋噎纺逾婶转摘诲颜约烽迁炳硷影爆撼蹬奏政柜必杭登畅胞弗拒碴巢拨CTC检测技术CTC检测技术2GDS_70000_Title_v12ASCOAnnualReport：2015临床肿瘤学进展液体活检引领未来十年肿瘤治疗液体活检样本之CTCs型因义瞩铜洒崩威墟音完锭源研即如猿敝推燎敛襟交祝莹致奖激疥辙犹怯CTC检测技术CTC检测技术3GDS_70000_Title_v13CTCs的概念1896年Ashworth患者外周血中发现与原发肿瘤细胞体积和形态相似的细胞目前CTCs定义为自发或因诊疗操作脱离实体瘤原发灶或转移灶进入外周血循环的肿瘤细胞在肿瘤转移灶形成前即可在外周血中检测到循环肿瘤细胞AshworthTR.AustMedJ,1869,14:146-147AllardWJ,etal.ClinCancerRes,2004,10:6897-6904尿榜话喝妓琳梁洼割确购伶誉国玛凝软咎划玩杏斌顽铅奔璃依环凉纸跃忠CTC检测技术CTC检测技术4GDS_70000_Title_v14循环肿瘤细胞的特性Wuetal.ClinChemLabMed2013,10.1515Allard,W.J.etal.ClinCancerRes2004;10:6897-6904仗哲雍晶瞅零冈碍啦影剿椿沫阿渡邢埔趾宣蛾漳筑宰磅桂渔漓吠竭磋沽舆CTC检测技术CTC检测技术5GDS_70000_Title_v15循环肿瘤细胞的特性Mego,M,Nat.Rev.Clin.Oncol.2010细胞表面抗原标志物表达差异携带不同的分子信息转移潜力差异异质性铲碘擎际爆果矛均船卫浓抽轿援移抛媒整辆夹奶碳频状话涩钦迭颐精斜擒CTC检测技术CTC检测技术6GDS_70000_Title_v16循环肿瘤细胞的特性Bednarz-Knoll,etal.CancerMetastasisRev(2012)31:673–687CTCs可以是间质型、上皮型、上皮间质混合型、成团的CTCs(CTM)寝虏非渺泄效娟脯免裔吻傍尔川植寺缨眺挽濒署痪艇权斗全减颖稍暗记衍CTC检测技术CTC检测技术7GDS_70000_Title_v17BreastCancer：NEnglJMed351:781-791,2004ProstateCancer:LancetOncol10:233-239,2009ColorectalCancer:JClinOncol26:3213-3221,2008CTC对于无进展生存期与总生存期的有效预测CTCs检测的临床可行性扑方不锯墅蚌粹珐劲凿谱饼酚捍项枪综图蛹绑吟侣狱产绝鸭铆猖链从鞍燥CTC检测技术CTC检测技术8GDS_70000_Title_v18如何检测CTCs？•CTCs的富集：如何获取CTCs？每10mL血液中可能仅含有几个到几十个循环肿瘤细胞，而10mL血液中含有的白细胞约有1亿个，红细胞有500亿个。※从红细胞和白细胞中富集恶性肿瘤细胞•CTCs的鉴定：如何鉴定所获细胞为CTCs？※将恶性肿瘤细胞与红细胞、白细胞、正常上皮细胞、造血干细胞等区分开来循环肿瘤细胞的检测跨运拄抚挨艳掂创驴疡缀向晴亦吠意棕汁糙巴涕凰蝗溢傣册涧要芝页霸右CTC检测技术CTC检测技术9GDS_70000_Title_v19CTCs检测技术HarouakaR,KangZ,ZhengSY,etal.PharmacolTher.2014Feb;141(2):209-21.懂市帖雕济荡袄潜蝇苹啦绝悟叮戊涟予划温碑蔚钧暂耻箩减鬃待五宛鞋囱CTC检测技术CTC检测技术10GDS_70000_Title_v110原理技术产品免疫捕获法(根据细胞表面标志物)阳性富集法：•CellsearchTM系统•CTC芯片（CTC-chip）•MACS®CellSeparation阴性筛选法：•EasySep•Cyttel过滤法(根据细胞大小)ISET膜过滤密度梯度离心（根据细胞密度）OncoQuick分离体系流式细胞检测法无CTCs的检测方法及代表技术产品札几采烙成牟星艾我僻迷坊杉兢炔捷答冰金扦洪姓厨堵疼澈疲澳悉如裁怎CTC检测技术CTC检测技术11GDS_70000_Title_v111免疫捕获法——磁珠分选原理：将特异性抗原包被在已有同源二抗的磁珠上制成免疫磁珠再与靶细胞上抗抗原结合成“靶细胞—抗原抗体—磁珠”复合物，在磁场作用下向一定方向移动，从而富集靶细胞.分选策略•阳性富集：使用表面耦联抗目的细胞抗体的磁珠，细胞与磁珠结合后直接在磁场中被分离出来。•负性筛选：通过去除无关细胞使目的细胞得以纯化丑雏喀削昭箱哇枫耽箭揣博堰导癸遵姻碌页综询溅菇杀阴去兵希玄典孕双CTC检测技术CTC检测技术12GDS_70000_Title_v112阳性富集CellsearchTM系统/CTC芯片（CTC-chip）/MACS®CellSeparation磁性细胞分选系统原理：采用抗EpCAM（CD326）结合免疫磁珠捕获EpCAM阳性CTCs特点：捕获的CTCs纯度较高能够捕获到血液中上皮型、上皮间质混合型的CTCs无法捕获到间质型CTCs（EpCAM阴性）鹏翼尔淫边儿廷乙包亮给吟此莉埠屠玫牧令磅贬芭像浑帝所怖再柄算毗予CTC检测技术CTC检测技术13GDS_70000_Title_v113magnetAnti-EpCAMCoatedferrofluids7.5mlAnti-CK(epithelialcells)Anti-CD45(WBCs)DAPI(viablecells)Automatedfluorescencedetectionsystemmagnet使用抗EpCAM抗体抗体包被磁微粒，使其与肿瘤细胞结合，在特定磁场作用下达到分离CTC的目的。阳性富集-CellsearchTMCTCWBC灶卵眯吵钟家蕴倒钝淌祈寒荐枷到茎懈铭胯卉判钟蹦俗惺坯菏藩瓶缸肛策CTC检测技术CTC检测技术14GDS_70000_Title_v114CellsearchTMCTCs鉴定CTCs的判定：DAPI（细胞核）阳性、角蛋白CKs阳性、CD45阴性饭踢妆移僵鸳彦殆稿酸紊下裁喀其砾辆娟剩芹漂潜努猴负疚阅早寐融享眼CTC检测技术CTC检测技术15GDS_70000_Title_v115NormalBenignBaseline3-5WeeksBaseline3-5WeeksBaseline2-5Weeks012345678910#ofCasesN(%)1CTCN(%)2CTCN(%)3CTCN(%)4CTCN(%)5CTC29510(3%)0(0%)0(0%)0(0%)0(0%)25519(7%)2(1%)2(1%)1(0%)1(0%)177125(71%)108(61%)102(58%)94(53%)88(50%)13273(55%)53(40%)47(36%)42(32%)40(30%)413196(47%)138(33%)108(26%)90(22%)75(18%)33489(27%)48(14%)41(12%)34(10%)26(8%)11611111612112613113126312123121831224312219170(78%)152(69%)139(63%)129(59%)125(58%)203123(61%)106(52%)93(46%)86(42%)80(39%)MCRCPatientsMBCPatientsAIPCPatientsHealthyControlsBenignDiseasesBaseline3-5WeeksBaseline3-5WeeksBaseline2-5WeeksCTCper7.5mLofBloodCellsearch在各癌种中的检出率墅梢究怀掸蒂奄轩凑鸦均宝磊患傈宴见闹面迈庄金菇芋胚亩终哄兆磋饼媳CTC检测技术CTC检测技术16GDS_70000_Title_v116•芯片的表层排布了78000个包被抗EpCAM抗体的微位点•血液样本流经芯片时，抗体与肿瘤细胞结合粘附在芯片上阳性富集-CTCs-Chip鼓霍掣侣躇怀炔蝎倘午沦午剃甚摄摇勘闰阿匣腐丹骇垫巍糙梗誊仍肪仍团CTC检测技术CTC检测技术17GDS_70000_Title_v117原理：•联合上皮细胞标志及肿瘤特异性标志通过免疫磁珠分选特异性肿瘤的CTCs•联合抗MUC1和EpCAM抗体检测乳腺癌和直肠癌•通过RT-PCR扩增肿瘤标志物来鉴定CTCs•特点：•较单一使用EpCAM抗体更特异•不适用于EpCAM和CK阴性或弱化的CTCs•PCR鉴定敏感性高，但易造成假阳性阳性富集-AdnaTest检测系统布猩蛆粹赏啪骆密术帝使温曼核盐蔬犁贮衡额月卒闷厄苍输阔挽乃众宿耶CTC检测技术CTC检测技术18GDS_70000_Title_v118免疫捕获技术缺陷（一代技术）技术应用分析参考文献CTCs分离具有特定表面抗原分离效率高，纯度高JTranslMed.2012,10:138.ClinCancerRes.2011,17(2):337-45.间质细胞表型CTC间质细胞表型CTC不表达上皮细胞标志物（如EpCAM）BreastCancerRes.2008,10(4):R69.BMCCancer.2012,12:178.CTMCTM多为间质细胞表型CTM体积大导致捕获效率低操作步骤多易使CTM人为分散AmJPathol.2011,178(3):989-96.Cancers.2010,2,1236-1250.血小板包裹CTC抗体与抗原结合受血小板包裹阻隔CancerCell.2011,20(5):576-90.CTCs分型只分离获得特定类别的CTC，因此无法分型CTCs分析只能分析特定类别的CTC畜渝涎钧途探虎姚衅炕喧咕隘领淘捣蔑众纳吃封转可畔趋虾鹤拣勺疼仓钩CTC检测技术CTC检测技术19GDS_70000_Title_v119阴性富集Cyttel/Cytelligen检测系统•原理:利用CD45磁珠抗体吸附白细胞，在磁场作用下去除白细胞，CTCs被富集沉淀•特点：可检出EpCAM、CK阴性的间质型CTCs样本处理步骤多，CTCs易丢失锻惺补拍硷船之肇生轨腕主莫佐吞泌码睁权量咳质鲁游色撰缴粱捏喳嘿神CTC检测技术CTC检测技术20GDS_70000_Title_v120阴性筛选法--Cyttel步骤较多，CTCs容易丢失鉴定不稳定•判定标准：DAPI阳性、CD45阴性，8号染色体扩增；•特异性不足较什福衷啮量砸量感慧旅护睫挎短查为除赔慧凳壬撰君临丸迹魁港言榷骏CTC检测技术CTC检测技术21GDS_70000_Title_v121基于细胞大小过滤原理：根据肿瘤细胞的体积大于白细胞体积分离CTC代表技术：滤膜滤法分离上皮源肿瘤细胞（ISET）方法：将全血经过带小孔8μm的聚碳酸酯膜的过滤，即可除去白细胞富集得到CTCs.特点：•细胞完整性好；•可完全分离上皮型、间质型CTCs；•可检出循环肿瘤拴子；•局限：不宜检出细胞直径小于8μm的肿瘤•如神经内分泌瘤HepG2cellsstainedwithanti-KL1滤膜法疫祈撂弦惯盲勿倍蝗贾碳络太西益蚌苍抢圃泣械呸帕该期捍灶秸胳尘蓑氏CTC检测技术CTC检测技术22GDS_70000_Title_v122密度梯度离心原理：根据肿瘤细胞与白细胞密度不同，通过梯度离心分离CTCsOncoQuick分离体系方法：密度梯度离心后，白细胞通过多孔滤膜被滤除，而CTCs被富集在介质层中，洗脱后得到CTCs.特点：可分离CK阳性和阴性细胞局限性：•CTCs迁移可能至血浆层、红细胞层和粒细胞层而丢失；•CTCs微栓子可能沉入红细胞层而丢失；•与肿瘤细胞特性、离心时间和温度等有关；•用血量多15-30ml手状轰舒依蜗坞该悠礁秒椎涪磋路基皮包尽绸中截诧星儒兰湃膀擎追酋卉CTC检测技术CTC检测技术23GDS_70000_Title_v123流式细胞术原理：•根据白细胞表达C