铜绿假单胞菌对龙葵中Cd的亚细胞分布和化学形态的影响

摘要：通过盆栽实验，研究Cd胁迫下铜绿假单胞菌对龙葵中Cd的亚细胞分布和化学形态的影响。盆栽实验中Cd浓度设为0、25、50、100mg·kg-1，采用差速离心法、化学试剂逐步提取法对龙葵中的Cd进行亚细胞分布和化学形态研究。研究结果表明，接种铜绿假单胞菌处理中龙葵叶的Cd含量为未接种的1.14~1.60倍，促进植株中的Cd由根部向茎叶的转移。接种处理可提高根中细胞壁组分的Cd比例，及叶中可溶组分的Cd含量，降低植株根和叶中细胞器组分的Cd比例高达45.74%。此外，接种铜绿假单胞菌可提高龙葵叶中低活性形态Cd的比例。因此，接种铜绿假单胞菌可通过促进龙葵中Cd向地上部分的转移，改变植株中Cd的分布和形态比例，加强龙葵对Cd的耐受性。这些结果有助于重金属污染土壤中植物-微生物共生关系的进一步研究。关键词：铜绿假单胞菌；龙葵；Cd；亚细胞分布；化学形态中图分类号：X53文献标志码：A文章编号：1672-2043（2018）08-1602-08doi:10.11654/jaes.2018-0130EffectsofPseudomonasaeruginosaonsubcellulardistributionandchemicalspeciationofCdinSolanumnigrumZHANGHai-li1,WANGTao1,ZOULu-yi1,YUHong-yan1,GUWen-xiu2,TENGYue1*（1.SchoolofEnvironmentandCivilEngineering,JiangnanUniversity,Wuxi214122,China;2.SchoolofChemicalandMaterialEngineering,JiangnanUniversity,Wuxi214122,China）Abstract：TheeffectsofPseudomonasaeruginosaonthedistributionandchemicalformsofCdinSolanumnigrumwerestudiedviaapot⁃tingexperiment.TheconcentrationofCdinthepotexperimentwassetat0,25,50,and100mg·kg-1.ThesubcellulardistributionandchemicalformsofCdinSolanumnigrumwerestudiedusingdifferentialcentrifugationandstepwiseextractionofchemicalreagent.There⁃sultsshowedthattheCdcontentofSolanumnigrumleavesinoculatedwithPseudomonasaeruginosawas1.14~1.46timeshigherthanthatofthenon-inoculatedleaves.PseudomonasaeruginosaalsopromotedthetransferofCdfromrootstostemsandleavesintheplants.Com⁃paredwiththenon-inoculationtreatment,inoculationincreasedtheCdproportioninthecellwalloftherootsandtheCdcontentinthesolu⁃blecomponentsoftheleaves.Inaddition,inoculationdecreasedCduptakebyupto45.87%intheorganellesofrootsandleaves.Moreover,inoculationwithPseudomonasaeruginosaincreasedtheproportionoflow-activityCdintheleavesofSolanumnigrum.Therefore,inocula⁃tionwithPseudomonasaeruginosacanpromotethetolerancetoCdofSolanumnigrumbypromotingthetransferofCdtoabovegroundpartsoftheplantandchangingthedistributionandformratioofCdintheplant.Theseresultswillbebeneficialforfurtherstudiesonplant-mi⁃crobesymbiosisinheavy-metal-contaminatedsoils.Keywords：Pseudomonasaeruginosa;Solanumnigrum;Cd;subcellulardistribution;chemicalforms收稿日期：2018-01-22录用日期：2018-03-29作者简介：张海利（1994—），女，河南焦作人，硕士研究生，从事污染土壤植物修复研究。E-mail：[e-mail]*通信作者：滕跃E-mail：[e-mail]基金项目：国家自然科学基金项目（21307043）；中国博士后科学基金项目（2016M590411）Projectsupported：TheNationalNaturalScienceFoundationofChina（21307043）；ChinaPostdoctoralScienceFoundation（2016M590411）2018，37（8）:1602-16092018年8月农业环境科学学报JournalofAgro⁃EnvironmentScience张海利，王涛，邹路易，等.铜绿假单胞菌对龙葵中Cd的亚细胞分布和化学形态的影响[J].农业环境科学学报,2018,37（8）：1602-1609.ZHANGHai-li,WANGTao,ZOULu-yi,etal.EffectsofPseudomonasaeruginosaonsubcellulardistributionandchemicalspeciationofCdinSolanumni⁃grum[J].JournalofAgro-EnvironmentScience,2018,37（8）：1602-1609.铜绿假单胞菌对龙葵中Cd的亚细胞分布和化学形态的影响张海利1，王涛1，邹路易1，郁红艳1，顾文秀2，滕跃1*（1.江南大学环境与土木工程学院，江苏无锡214122；2.江南大学化学与材料工程学院，江苏无锡214122）张海利，等：铜绿假单胞菌对龙葵中Cd的亚细胞分布和化学形态的影响2018年8月Cd污染主要来自于人类的农业和工业活动，如废水灌溉、金属矿石的开采和冶炼等[1]。由于Cd具有生物毒性强、分布范围广、不能被生物降解且迁移性强等特点，使其易被植物吸收并积累，从而通过食物链富集，危害人类健康[2]。因此，Cd污染及其修复技术得到全球越来越多的关注[3]。植物修复是一种成本低、环保的污染土壤修复技术，主要应用超积累植物修复受污染土壤。现已发现大量植物物种可超量积累重金属[4-5]，但植物修复在实践过程中仍存在局限性，其修复效率受多种因素的影响，如植物生长缓慢、生物量小、对重金属的耐受性有限等[6]，而使用植物-微生物联合修复重金属污染土壤，是提高植物修复效率的有效方法[7-8]。铜绿假单胞菌是一种具有金属抗性的菌种，Zhang等[9]从煤矿区的污染土壤中分离出两株铜绿假单胞菌菌株ZGKD5和ZGKD2，均对Cd、Cu、Zn、Ni和Pb表现出高耐受性。且大量研究表明，在植物修复盆栽实验中，铜绿假单胞菌可促进植物生长，提高Cd积累量。例如，Liang等[10]的研究中，接种从重金属污染的污泥中分离的铜绿假单胞菌显著增强紫堇的Cd积累；Xie等[11]研究表明，接种铜绿假单胞菌ATCC9027可缓解Cd的毒性，促进苎麻生长，并提高Cd积累；Biswas等[12]研究表明，从废水中筛选出的铜绿假单胞菌KUJM具有多重重金属抗性潜力，并促进扁豆种子生长，具有用于污染土壤植物修复的潜能。关于铜绿假单胞菌的研究均处于对植物生长和积累总量的水平，而铜绿假单胞菌如何影响植物重金属积累和分布的其他方面仍不确定。Cd超积累植物龙葵生长周期短、生物量大，且已被证明其耐受并吸收土壤中Cd[13]，具有良好的应用前景[14-16]。研究表明，植物的金属耐受性和解毒机制可通过亚细胞分布限制毒素或改变其化学结构实现[17-19]。然而，铜绿假单胞菌对龙葵中Cd积累和分布的影响尚无报道。本研究以龙葵和从Cd污染土壤筛选出的铜绿假单胞菌为研究材料，采用差速离心法和化学试剂逐步提取法，通过研究龙葵各部位中Cd的积累、亚细胞分布和化学形态，来分析铜绿假单胞菌对其的影响，探讨铜绿假单胞菌作用下龙葵对Cd的耐受机制，期望为龙葵在植物修复中的应用提供理论参考。1材料与方法1.1供试材料盆栽实验用土取自江苏省江阴市农田土，风干后过2mm筛。土壤理化性质：pH5.59，总氮1g·kg-1，有机质27.35g·kg-1，速效磷18.81mg·kg-1，速效钾75.46mg·kg-1，Cd2.64mg·kg-1。供试菌株为课题组从Cd污染土壤中已筛选出的Cd耐受性细菌，利用BLAST软件将测得Cd耐受细菌基因序列与GenBank上相关的16SrDNA序列进行同源性比较，得出此菌与Pseudomonasaeruginosa铜绿假单胞菌同源性为99%。1.2实验设置与处理盆栽实验土壤的Cd含量设4个水平分别为0、25、50、100mg·kg-1，不同Cd浓度的土壤分为接种和不接种铜绿假单胞菌两种情况，共8个处理，每个处理3次重复。Cd以CdCl2溶液的形式加入已过筛的土壤中充分搅拌，稳定2周后进行高温灭菌（121℃，30min）处理。将灭菌后的土壤装入塑料盆（直径18cm，高11.5cm）中，每盆均装土2kg。挑选优良的龙葵种子于70%的乙醇中浸泡30min，无菌蒸馏水清洗3次，再于2%的NaClO2溶液中浸泡10min后用蒸馏水洗净，表面灭菌后种植盆中。接种组每周以细菌悬浮液的形式接种铜绿假单胞菌。将培养于LB固体培养基中的铜绿假单胞菌转移至盛有50mL的LB液体培养基的锥形瓶中，于恒温振荡器（150r·min-1，37℃）中振荡48h，富集后离心（6000r·min-1，4℃）10min收集细菌细胞，再用生理盐水洗涤两次获得OD600值近似为0.6的接种物（约108CFU·mL-1），每盆接种5mL做接种处理[11，20]。所有实验均在自然光照的温室中进行，60d后收获植物，自来水冲洗后，去离子水洗净，吸干表面水分。1.3植物亚细胞组分的分离植物亚细胞组分的分离采用差速离心法，参考Weigel等[21]的方法，并略加改动。称取根、叶鲜样各0.2g，加入20mL预冷提取液[Tris-HCl（pH7.5）50mmol·L-1，蔗糖250mmol·L-1，DTT1mmol·L-1]，研磨匀浆后3000×g下离心15min，沉淀为细胞壁组分（F1）；取上清液在12000×g下离心30min，沉淀为细胞器组分（F2）；上清液即为细胞可溶组分（F3）。全部操作在4℃下进行。1.4植物Cd化学形态提取植株Cd的化学形态分析采用化学试剂逐步提取法。准确称取根、叶鲜样0.2g，加入20mL提取液研磨匀浆后转入50mL锥形瓶中，25℃恒温振荡22h后，在5000×g下离心10min，倒出上清液，再加入20mL提取液，25℃恒温振荡2h，在5000×g下离心101603农业环境科学学报第37卷第8期表1龙葵根、茎、叶中的Cd含量Table1ThecontentofCdinroots，stemsandleavesofSolanumnigrummin，倒出上清液，合并两次上清液得该提取