云南玉溪地区烟田根结线虫的SCAR鉴定、-分布及其生物防治研究

农业资源与环境学报2019年7月·第36卷·第4期：546-552July2019·Vol.36·No.4：546-552JournalofAgriculturalResourcesandEnvironment*,RUANWei-bin1（1.CollegeofLifeSciences,NankaiUniversity,Tianjin300071,China;2.YuxiCompanyofYunnanProvincialTobaccoCompany,Yuxi653100,China;3.ApplicationTechnologyofBiologicalControlforTobaccoDiseasesandInsectPestsEngineeringResearchCenterofChi⁃naTobacco,Yuxi653100,China）Abstract：YuxiisthemaintobaccoproducingareainChina.Root-knotnematodediseaseistheimportantundergrounddiseasesintobaccoproduction,whichhasendangeredtobaccoplantgrowthandreducedtobaccoyield.Inthisstudy,theSCAR-PCRmethodwasusedtoiden⁃tifytheroot-knotnematodesinYuxi,YunnanProvince,andthedistributionofdifferentroot-knotnematodesineachcountywasanalyzed.ThefieldexperimentwasperformedinChengjiangandYimenCountiesinYuxi.TheresultsshowedthatMeloidogynearenariawasthedominantspeciesinYuxiregion,whichwasdistributedinallcounties.M.javanicawastheminorspecies,andM.incognitawasrareinYuxi.Andtheapplicationofentomopathogenicnematodesinthefieldcouldsignificantlyinhibittheoccurrenceofroot-knotnematodesintobacco.Theresultsabovecouldprovidedatasupportforthegreencontroloftobaccoroot-knotnematodedisease.Keywords：entomopathogenicnematode;biocontrol;root-knotnematodes;Yuxi;tobacco云南玉溪地区烟田根结线虫的SCAR鉴定、分布及其生物防治研究宋莉1，周培培1，李阳1，张立猛2，3，赵进龙2，3，张翠萍2，罗秀莲2，纳红艳2，刘芳2，谷星慧2，3*，阮维斌1（1.南开大学生命科学学院，天津300071；2.云南省烟草公司玉溪市公司，云南玉溪653100；3.烟草行业病虫害生物防治工程研究中心，云南玉溪653100）收稿日期：2018-08-30录用日期：2018-10-09作者简介：宋莉（1994—），女，河北张家口人，硕士研究生，主要从事农作物病虫害的生物防治研究。E-mail：[e-mail]*通信作者：谷星慧E-mail：[e-mail]基金项目：中国烟草总公司云南省公司科技计划项目（2017YN15，2014YN21）Projectsupported：YunnanProvincialCompanyofNationalTobaccoCorporation（2017YN15，2014YN21）摘要：云南玉溪地区是我国的烟草主产区，根结线虫病是烟草生产中的重要地下病害，危害烟草植株生长，降低产量。本研究运用SCAR-PCR方法对云南玉溪地区根结线虫进行分子鉴定，并分析不同根结线虫种类在各县区的分布情况；同时在澄江、易门两县开展利用昆虫病原线虫对根结线虫的田间防治试验。结果表明，玉溪地区主要的优势种群为花生根结线虫Meloidogynearenaria，在所有区县均有分布，爪哇根结线虫M.javanica为次要种群，南方根结线虫M.incognita属于零星分布；田间施加昆虫病原线虫对烟草根结线虫病具有显著的抑制作用。研究结果可为烟草根结线虫病的绿色防治提供数据支持。关键词：昆虫病原线虫；生物防治；根结线虫；玉溪；烟草中图分类号：S476文献标志码：A文章编号：2095-6819（2019）04-0546-07doi:10.13254/j.jare.2018.0219宋莉，周培培，李阳，等.云南玉溪地区烟田根结线虫的SCAR鉴定、分布及其生物防治研究[J].农业资源与环境学报,2019,36（4）:546-552.SONGLi,ZHOUPei-pei,LIYang,etal.DistributionofMeloidogynespp.intobaccofieldofYuxi,YunnanProvinceandbiologicalcontrolagainstMeloidogynespp.[J].JournalofAgriculturalResourcesandEnvironment,2019,36（4）:546-552.——5462019年7月宋莉，等：云南玉溪地区烟田根结线虫的SCAR鉴定、分布及其生物防治研究植物寄生线虫造成全球经济损失年均可达1600亿元[1]。其中根结线虫（Meloidogynespp.）为最主要植物病原线虫，其寄主广泛，常见寄主多达2000余种[2]，危害植物生长。根结线虫病是世界性的烟草主要病害[3]，更是限制我国烟草生产的主要因素之一，仅云南省每年发病面积就超2万hm2，致使烟叶减产，造成重大经济损失[4]。烟草根结线虫病不仅直接危害烤烟的产量与质量[5]，而且还会使烤烟的抗性降低，导致烟草黑胫病、根黑腐病等一系列病害的发生[6]。长期以来，对该病的防治主要以化学药剂为主，但由于其抗药性、环境污染及农药残留等问题而使大量的农药被禁用。通常情况下，烟农一般采用烟草和其他作物轮作进行种植。根结线虫不仅对烟草造成损失，也会对下茬作物造成危害。不同种类的根结线虫对作物的危害不同，因此对根结线虫种类的鉴定、分布研究对推动相应地区的农业持续发展具有重要意义。SCAR（Sequencecharacterizedamplifiedregion）-PCR是一种可靠的鉴定根结线虫的方法[7-8]，本研究采用该方法对云南玉溪地区根结线虫种类进行鉴定。生物防治具有可持续治理及保护生物多样性的优势，是近年来发展速度较快的防治方法，是国内外研究和应用的热点，取得了多方面的研究进展。其中，昆虫病原线虫（Entomopathogenicnematode，EPN）是一类具有巨大潜力的生物防治因子。昆虫病原线虫作为一种理想的生物杀虫剂，具有以下优点：寄主范围广[9]；对寄主昆虫具有主动搜寻能力；自我增殖快、易于遗传改良；能够以人工培养基低成本大量培养；对人畜无害，在欧美一些国家可以豁免注册生产和释放；田间施用时可与多种化学农药混合使用，并能以传统喷药设备施用。近年来，许多国内外研究学者已经发现了昆虫病原线虫具有抑制植物线虫的作用，特别是利用昆虫病原线虫防治根结线虫的研究逐渐展开。宋洁等[10]研究发现，昆虫病原线虫体内携带的共生细菌对大豆胞囊线虫和根结线虫的卵孵化均表现出明显的抑制作用。Molina等[11]的研究表明，活的或死的夜蛾斯氏线虫（Steinernemafeltiae）和异小杆线虫（Heterorhabditisbaujardi）均能够显著抑制番茄上M.mayaguensis的卵孵化和二龄幼虫的侵染。Valle等[12-13]利用感染了EPN的大蜡螟（Galleriamellonella）虫尸研究其对胡椒和西葫芦南方根结线虫病的抑制作用，结果显示，虫尸能减少植株根上根结数和卵囊中的卵块数。王宇坤等[14]也发现EPN能够显著降低经济作物烟草根结线虫的卵粒数。但这些研究基本是室内试验，而相关的田间应用试验鲜有报道[15]。本研究首先对云南省玉溪市根结线虫进行鉴定与分布调查，然后在澄江县和易门县布置田间试验，探究昆虫病原线虫对根结线虫的防治效应，旨在为绿色防控该地区的根结线虫危害提供相应的理论依据。1材料与方法1.1样品采集对云南省玉溪市八县一区的试验样地土壤进行理化性质分析，包括pH值、有机质含量、土粒密度、容重、总孔隙度、质地类型等，由云南同川农业分析测试技术有限公司检测。根据往年发病情况，结合各县区当年烤烟种植区域、品种，对烤烟根结线虫发生危害情况进行调查，得出各县区烤烟根结线虫发生区域、面积等。在调查的基础上，在每个县区选择2个根结线虫发病严重的地块，每个地块选择1株发病最严重的烟株，连根带土挖起，去掉茎叶。保留根结密集部位约500g左右的根结样品，放入采样袋中，并尽快运回实验室进行根结线虫的种类鉴定。采样时记录GPS信息。1.2SCAR-PCR法根结线虫种类鉴定参考文献[8]中SCAR-PCR方法对根结线虫进行分子鉴定。DNA提取：根系可直接用来挑取线虫，在根结明显部位挑取雌虫，用非常细的毛笔或解剖针挑取至少5条线虫至含提取液（8μLddH2O和1μL10×ExTaq缓冲液，不含Mg2+）的200μLPCR管中，液氮冷冻1min后，置于65~95℃水浴或PCR仪中2min，重复4次；然后向PCR管中加入1μL1mg·mL-1蛋白酶K，65℃温1h后，置于95℃下10min。PCR引物：采用的SCAR标记引物见表1。对四种主要根结线虫进行种类鉴定：南方根结线虫（Meloidogyneincognita），花生根结线虫（M.arenaria），爪哇根结线虫（M.javanica）和北方根结线虫（M.hap⁃la）。PCR扩增：PCR反应体系（25μL）为DNA模板2μL，上、下游引物（2.5μmol·L-1）分别为2μL（共4μL），dNTPs（2.5mmol·L-1）2.5μL，MgCl2（2.5mmol·L-1）2μL，10×Extaq缓冲液（不含Mg2+）2.5μL，ExtaqDNA聚合酶0.5μL，加ddH2O至25μL。覆盖一层矿物油。扩增条件为94℃预变性30s，60~62℃退火30——547农业资源与环境学报·第36卷·第4期，72℃延伸1min，40个循环；72℃延伸10min。电泳：PCR扩增产物使用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，用DL2000DNAMarker作为对照，经溴化乙锭染色后，在凝胶成像仪上进行观察和拍照记录。1.3昆虫病原线虫田间防治试验1.3.1试验设计试验于2015年5—9月在玉溪澄江县和易门县进行，分别选取往年根结线虫发生较重区域布置田间对比试验。供试材料为经根结线虫侵染的烤烟；供试昆虫病原线虫为异小杆科线虫（Heterorhabditisbacte⁃riophora），由南开大学提供。