肝移植术后发生急性排斥的患者外周血滤泡杀伤性T淋巴细胞的表达特点及临床意义-张可

*?Y()@A&fgiBCDE1)Ｔ&F;KLGH张　可ａ，杨　帆ａ，孙艳玲ｂ，刘振文ｂ，王福生ａ，施　明ａ（北京大学解放军三二医院教学医院ａ．感染性疾病诊疗与研究中心；ｂ．肝移植研究中心，北京１０００３９）摘要：目的　研究肝移植患者外周血中滤泡杀伤性Ｔ淋巴细胞（Ｔｆｃ）的表达特征及其在急性排斥反应中的意义。方法　收集２０１５年１２月－２０１７年２月解放军第三二医院肝移植研究中心接受肝移植患者３６例，其中１１例发生急性排斥反应（ＡＲ组），余下２５例未发生排斥反应（ＮＡＲ组），急性排斥反应均由病理诊断确诊。另选取体检中心健康者２０例作为对照（ＨＣ组）。应用流式细胞仪检测外周血中Ｔｆｃ的特点，并分析其与总Ｂ淋巴细胞、幼稚Ｂ淋巴细胞和类别转换记忆性Ｂ淋巴细胞和浆细胞以及肝功能指标之间的相关性。计量资料多组间比较采用Ｋｒｕｓｋａｌ－ＷａｌｌｉｓＨ检验，进一步两两比较采用Ｍａｎｎ－ＷｈｉｔｎｅｙＵ检验，相关性分析采用Ｓｐｅａｒｍａｎ秩相关。结果　３组之间患者外周血Ｔｆｃ的频率差异有统计学意（Ｈ＝３２１８，Ｐ＜０００１），ＡＲ组患者外周血中Ｔｆｃ的频率明显高于ＮＡＲ组（Ｕ＝６０，Ｐ＝０．００８）和ＨＣ组（Ｕ＝２，Ｐ＜０．００１），ＮＡＲ组Ｔｆｃ的表达明显高于ＨＣ组（Ｕ＝４０，Ｐ＜０．００１）。Ｔｆｃ频率与总Ｂ淋巴细胞、幼稚Ｂ淋巴细胞呈正相关（ｒ值分别为０．６６５、０．４６２，Ｐ值均＜０．００１）；与类别转换记忆性Ｂ淋巴细胞和浆细胞呈负相关（ｒ＝－０．４５３，Ｐ＝０．００１）；与血清ＧＧＴ水平呈正相关（ｒ＝０．３７１，Ｐ＝０．０２６）。结论　肝移植术后发生急性排斥反应的患者外周血中Ｔｆｃ频率升高，且与Ｂ淋巴细胞以及肝脏胆管损伤存在一定的相关性，Ｔｆｃ可能参与了肝移植术后的急性排斥反应。关键词：肝移植；移植物排斥；Ｔ淋巴细胞中图分类号：Ｒ６１７　　　文献标志码：Ａ　　　文章编号：１００１－５２５６（２０１７）０７－１３３６－０４ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｏｆｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｆｏｌｌｉｃｕｌａｒｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴｃｅｌｌｓｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｅｘｐｅｒｉｅｎｃｉｎｇａｃｕｔｅｒｅｊｅｃｔｉｏｎａｆｔｅｒｌｉｖｅｒｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎＺＨＡＮＫＫｅ，ＹＡＮＧＦａｎ，ＳＵＮＹａｎｌｉｎｇ，ｅｔａｌ．（ＴｒｅａｔｍｅｎｔａｎｄＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒｆｏｒＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅｓ，３０２ＭｉｌｉｔａｒｙＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＣｈｉｎａ－ＰｅｋｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＴｅａｃｈｉｎｇＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００３９，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｆｏｌｌｉｃｕｌａｒｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴ（Ｔｆｃ）ｃｅｌｌｓｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｕｎｄｅｒｇｏｉｎｇｌｉｖｅｒｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｉｒｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｉｎａｃｕｔｅｒｅｊｅｃｔｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ａｔｏｔａｌｏｆ３６ｐａｔｉｅｎｔｓｗｈｏｕｎｄｅｒｗｅｎｔｌｉｖｅｒｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎｉｎＬｉｖｅｒＴｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒｉｎ３０２ＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＰＬＡｆｒｏｍＤｅｃｅｍｂｅｒ２０１５ｔｏＦｅｂｒｕａｒｙ２０１７ｗｅｒｅｅｎｒｏｌｌｅｄ，ａｎｄａｍｏｎｇｔｈｅｓｅｐａｔｉｅｎｔｓ，１１ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅｄａｃｕｔｅｒｅｊｅｃｔｉｏｎ（ＡＲｇｒｏｕｐ）ａｎｄ２５ｄｉｄｎｏｔｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅａｃｕｔｅｒｅｊｅｃｔｉｏｎ（ＮＡＲｇｒｏｕｐ）．Ａｃｏｎｆｉｒｍｅｄｄｉａｇｎｏｓｉｓｏｆａｃｕｔｅｒｅｊｅｃｔｉｏｎｗａｓｍａｄｅｂｙｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｄｉａｇｎｏｓｉｓ．Ａｎｏｔｈｅｒ２０ｈｅａｌｔｈｙｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓｉｎＰｈｙｓｉｃａｌＥｘａｍｉｎａｔｉｏｎＣｅｎｔｅｒｗｅｒｅｅｎｒｏｌｌｅｄａｓｃｏｎｔｒｏｌｓ（ＨＣｇｒｏｕｐ）．ＦｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙｗａｓｕｓｅｄｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆＴｆｃｉｎｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄａｎｄｉｔｓｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｗｉｔｈｔｏｔａｌＢｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，ｊｕｖｅｎｉｌｅＢｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，ｍｅｍｏｒｙＢｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，ｐｌａｓｍａｃｅｌｌｓ，ａｎｄｌｉｖｅｒｆｕｎｃｔｉｏｎｐａｒａｍｅｔｅｒｓ．ＴｈｅＫｒｕｓｋａｌ－ＷａｌｌｉｓＨｔｅｓｔｗａｓｕｓｅｄｆｏｒｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｄａｔａｂｅｔｗｅｅｎｍｕｌｔｉｐｌｅｇｒｏｕｐｓ，ａｎｄｔｈｅＭａｎｎ－ＷｈｉｔｎｅｙＵｔｅｓｔｗａｓｕｓｅｄｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｂｅｔｗｅｅｎａｎｙｔｗｏｇｒｏｕｐｓ；Ｓｐｅａｒｍａｎｒａｎｋｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｗａｓｕｓｅｄｆｏｒｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ＴｈｅＡＲｇｒｏｕｐｈａｄａｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｆｒｅｑｕｅｎｃｙｏｆＴｆｃｉｎｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｔｈａｎｔｈｅＮＡＲｇｒｏｕｐ（Ｕ＝６０，Ｐ＝０．００８）ａｎｄｔｈｅＨＣｇｒｏｕｐ（Ｕ＝２，Ｐ＜０．００１），ａｎｄｔｈｅＮＡＲｇｒｏｕｐｈａｄａｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｆｒｅｑｕｅｎｃｙｏｆＴｆｃｔｈａｎｔｈｅＨＣｇｒｏｕｐ（Ｕ＝４０，Ｐ＜０．００１）．ＴｈｅｆｒｅｑｕｅｎｃｙｏｆＴｆｃｗａｓｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙｃｏｒｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈｔｏｔａｌＢｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓａｎｄｊｕｖｅｎｉｌｅＢｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ（ｒ＝０．６６５ａｎｄ０．４６２，ｂｏｔｈＰ＜０．００１），ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙｃｏｒｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈｍｅｍｏｒｙＢｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓａｎｄｐｌａｓｍａｃｅｌｌｓ（ｒ＝－０．４５３，Ｐ＝０００１），ａｎｄｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙｃｏｒｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈｓｅｒｕｍｇａｍｍａ－ｇｌｕｔａｍｙｌｔｒａｎｓｐｅｐｔｉｄａｓｅｌｅｖｅｌ（ｒ＝０．３７１，Ｐ＝０．０２６）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　ＴｈｅｒｅｉｓａｎｉｎｃｒｅａｓｅｉｎｔｈｅｆｒｅｑｕｅｎｃｙｏｆｐｅｒｉｐｈｅｒａｌＴｆｃｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｈｏｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅａｃｕｔｅｒｅｊｅｃｔｉｏｎａｆｔｅｒｌｉｖｅｒｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈｉｓｃｏｒｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈＢｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓａｎｄｈｅｐａｔｉｃｂｉｌｅｄｕｃｔｉｎｊｕｒｙ．Ｔｆｃｍａｙｂｅｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎａｃｕｔｅｒｅｊｅｃｔｉｏｎａｆｔｅｒｌｉｖｅｒｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｌｉｖｅｒｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ；ｇｒａｆｔｒｅｊｅｃｔｉｏｎ；Ｔ－ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－５２５６．２０１７．０７．０２７收稿日期：２０１７－０１－１２；修回日期：２０１７－０２－０９。基金项目：国家自然科学基金（８１５７１５６７）作者简介：张可（１９９１－），女，主要从事肝病的基础与临床研究。通信作者：施明，电子信箱：[e-mail]。６３３１临床肝胆病杂志第３３卷第７期２０１７年７月　ＪＣｌｉｎＨｅｐａｔｏｌ，Ｖｏｌ．３３Ｎｏ．７，Ｊｕｌ．２０１７　　肝移植是治疗终末期肝病的重要方法。肝脏不同于其他器官，是“免疫特惠”器官，即使阳性Ｔ淋巴细胞交叉配型也不会发生超急性排斥反应［１］。但急性排斥反应仍是肝移植失败的重要原因之一［２］。已有的研究［３－６］表明，辅助性Ｔ淋巴细胞２、辅助性Ｔ淋巴细胞１７、调节性Ｔ淋巴细胞、γδＴ淋巴细胞、自然杀伤细胞和树突状细胞等均参与了同种异体移植物的免疫反应。最近的研究［７－１１］发现ＣＤ４＋ＣＸＣＲ５＋滤泡辅助性Ｔ淋巴细胞参与了小肠移植、肾移植、造血干细胞移植和肝移植后的免疫反应。ＣＤ８＋ＣＸＣＲ５＋Ｔ淋巴细胞被命名为滤泡杀伤性Ｔ淋巴细胞（ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒｃｙｔｏｔｏｘｉｃＴｃｅｌｌｓ，Ｔｆｃ）［１２］，研究［１３］表明其在某种程度上也可以支持淋巴器官中Ｂ淋巴细胞和ＩｇＧ的产生。肝移植排斥患者肝脏组织中Ｂ淋巴细胞和浆细胞表达增加，且在肝移植排斥早期，Ｂ淋巴细胞及浆细胞的趋化因子表达亦增加［１４］。但Ｂ淋巴细胞、浆细胞以及Ｔｆｃ在肝移植排斥中的作用，特别是在急性排斥反应中的作用尚不清楚。本文对肝移植术后发生急性排斥反应患者外周血中Ｔｆｃ和Ｂ淋巴细胞的频率进行研究，并结合临床指标，探讨Ｔｆｃ在肝移植急性排斥免疫反应中可能发挥的作用。１　资料与方法１．１　研究对象　收集２０１５年１２月－２０１７年２月本院肝移植研究中心收治的肝移植术后患者３６例，其中移植术后未发生急性排斥反应者（ＮＡＲ组）２５例，术后１年内患者一般情况良好，未出现急性排斥反应和原发病的复发，也未出现慢性排斥反应及其他相关并发症。ＮＡＲ组中男１９例，女６例，年龄３２～６６岁，平均（５０．７±８．５）岁。移植术后发生急性排斥反应者（ＡＲ组）１１例，其中男８例，女３例，年龄３８～６９岁，平均（４９．２±１０．２）岁。急性排斥反应均由病理诊断确诊。所有患者在移植术后早期采用“糖皮质激素＋钙调磷酸酶抑制剂（ＦＫ５０６）＋吗替麦考酚酯”三联免疫抑制方案，术后３个月内停用激素，３个月后根据患者情况，单独使用ＦＫ５０６或联合使用吗替麦考酚酯。另选取２０例本院体检中心的健康人作为对照（ＨＣ组），其中男１６例，女４例，年龄３６～６０岁，平均（４９３±６．４）岁，肝功能及其他检查结果均正常，既往无肝病史。所有受试者均签署知情同意书。１．２　研究方法１．２．１　标本处理　所有研究对象均于清晨空腹采集静脉血７ｍｌ，肝素钠抗凝。用淋巴细胞分离液（天津美德太平洋有限责任公司）以密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，采用ＰＢＳ洗涤２次并计数。１．２．２　流式细胞仪检测外周血Ｔｆｃ及Ｂ淋巴细胞　取新鲜分离的外周血单个核细胞１００μｌ（共１×１０６个细胞），加入流式抗体ＣＤ３－ＢＶ５１０、ＣＤ８－Ｐｅｒｃｐ、ＣＸＣＲ５－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、ＣＤ１９－ＰＥ、ＩｇＤ－Ｐｅｒｃｐ、ＣＤ２７－ＡＰＣ，室温避光孵育２０ｍｉｎ，ＰＢＳ洗涤后，加１％多聚甲醛固定，４℃保存，２４ｈ内使用ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ流式细胞仪检测。１．３　统计学方法　采用ＳＰＳＳ１９．０软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ｘ±ｓ）表示，多组间比较采用Ｋｒｕｓｋａｌ－ＷａｌｌｉｓＨ检验，进一步两两比较采用Ｍａｎｎ－ＷｈｉｔｎｅｙＵ检验。相关性分析采用Ｓｐｅａｒｍａｎ秩相关。Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。２　结果２．１　外周血Ｔｆｃ及Ｂ淋巴细胞亚群的表达特点　ＣＤ８＋Ｔ淋巴细胞中Ｔｆｃ的频率在３组间比较差异有统计学意义（Ｈ＝３２．１８，Ｐ＜０００１），其中肝移植术后患者外周血中Ｔｆｃ频率ＡＲ组高于ＮＡＲ组（Ｕ＝６０，Ｐ＝０．００８）和ＨＣ组（Ｕ＝２，Ｐ＜０．００１），ＮＡＲ组高于ＨＣ组（Ｕ＝４０，Ｐ＜０．００１）（图１，２ａ）。总Ｂ淋巴细胞（ＣＤ１９＋）和幼稚Ｂ淋巴细胞（ＣＤ１９＋ＩｇＤ＋ＣＤ２７－）３组间比较差异均有统计学意义（Ｈ值分别为１４２１、２３４６，Ｐ值分别为０００１、＜０００１），进一步比较，总Ｂ淋巴细胞（ＣＤ１９＋）和幼稚Ｂ淋巴细胞（ＣＤ１９＋ＩｇＤ＋ＣＤ２７－）频率ＮＡＲ组和ＡＲ组均高于ＨＣ组（Ｕ值分别为１０３、４０、６０、１９，Ｐ值分别为０００１、０．００４、＜０００１、＜０．００１）（图２ｂ，ｃ）。而类别转换记忆性Ｂ淋图１　３组外周血Ｔｆｃ频率流式图７３３１张可，等．肝移植术后发生急性排斥的患者外周血滤泡杀伤性Ｔ淋巴细胞的表达特点及临床意义巴细胞和浆细胞（ＣＤ１９＋ＩｇＤ－ＣＤ２７＋）频率３组间比较差异亦有统计学意义（Ｈ＝２５２４，Ｐ＜０００１），进一步比较结果显示ＨＣ组高于ＮＡ