搜索
4.哺乳动物细胞siRNA转染4.1转染方法：将制备好的siRNA、siRNA表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法主要有以下几种：磷酸钙共沉淀；电穿孔法；DEAE-葡聚糖和polybrene；机械法；阳离子脂质体试剂。目前用的最多的是阳离子脂质体法。4.1.1磷酸钙共沉淀将氯化钙，RNA(或DNA)和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。4.1.2电穿孔法电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平（50%或更高）的毒性。4.1.3DEAE-葡聚糖和polybrene带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的DNA分子使得DNA可以结合在细胞表面。通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA复合体导入。两种试剂都已成功用于转染。DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。4.1.4机械法转染技术也包括使用机械的方法，比如显微注射和基因枪（biolisticparticle）。显微注射使用一根细针头将DNA，RNA或蛋白直接转入细胞质或细胞核。基因枪使用高压microprojectile将大分子导入细胞。4.1.5阳离子脂质体试剂在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时，其可以形成微小的（平均大小约100-400nm）单层脂质体。这些脂质体带正电，可以靠静电作用结合到DNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。因此使用阳离子脂质体转染的原理与以前利用中性脂质体转染的原理不同。使用阳离子脂质体试剂，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物。据称，一个约5kb的质粒会结合2-4个脂质体。被俘获的DNA就会被导入培养的细胞。现存对DNA转导原理的证据来源于内吞体和溶酶体。4.2转染步骤：4.2.1.转染的一般性指导（以Invitrogen的Lipofectamine™2000为例）1)为了获得最佳基因阻断结果，每一种细胞系转染siRNA的量都需要经过实验确定。如果您是首次转染您的细胞系，推荐尝试使用几个Lipofectamine™2000的浓度，并在20-100nM范围内改变siRNA的浓度，以确定达到最佳基因阻断水平所需要的条件。高浓度的siRNA可能具有细胞系依赖性。（注：我们推荐开始时使用40nMsiRNA。）2)在30-50％细胞汇合度时进行转染。通常基因沉默分析至少要在转染后24-72小时进行。低密度转染细胞可以使转染和分析之间更长的间隙更长，从而使由于细胞过度生长造成的细胞活性损害减少到最低。根据靶基因的特性，高密度转染的细胞可能更加适合条件的优化。3)不要在转染时的培养基中加入抗生素，因为这将会降低细胞转染的效率和导致细胞死亡。4)为了获得更好的结果，可以使用Invitrogen的Opti-MEM低血清培养基在形成复合物前稀释Lipofectamine™2000和siRNA。5)可以使用荧光标记的siRNA帮助优化细胞系的转染条件*。一旦确定了用来转染的最佳条件，可以在每一次实验都包括荧光标记siRNA，作为转染效率的指示剂。*化学合成荧光标记siRNA的种类（对应的页码和目录号）4.2.2常规瞬时转染（以24孔板为例）1)siRNA/shRNA表达载体的转染I．准备细胞：贴壁细胞：转染前24hrs，在500µL无抗完全培养基中接种0.5-2×105个细胞，转染时细胞融合度为80-90%。(注：铺板时要将细胞消化完全混匀，避免细胞堆积生长。)悬浮细胞：转染前24小时，在500µL无抗完全培养基中接种0.5-2×105个细胞，转染时细胞数量应在4-8×105/孔。II．对于每个转染样品，按下面的方法准备：z用50µLOpti-MEM稀释0.8µg质粒DNA，轻轻吹吸3-5次混匀。z轻轻颠倒混匀转染试剂，用50µLOpti-MEM稀释2.0µLLipofectamineTM2000，轻轻吹吸3-5次混匀，室温下静置5min。z混合转染试剂和质粒DNA稀释液，轻轻吹吸3-5次混匀，室温下静置20min。z转染复合物加入到24孔细胞板中，100µL/孔，前后轻摇细胞板混合均匀。z将细胞板置于37oC、5%CO2培养箱中培养18-48hrs。转染4-6hrs后可换新鲜培养基。AB 2)siRNA的转染（24孔板为例）I．准备细胞：贴壁细胞：转染前24hrs，在500µL无抗培养基中接种0.5-2×105个细胞，转染时细胞融合度为30-50%。(注：铺板时要将细胞消化完全混匀，避免细胞堆积生长。)悬浮细胞：转染前24hrs，在500µL无抗培养基中接种0.5-2×105个细胞，转染时细胞数量应在4-8×105/孔。II．对于每个转染样品，按下面的方法准备：z用50µLOpti-MEM稀释siRNA(转染细胞的终浓度为33nM)，轻轻吹吸3-5次混匀。z轻轻颠倒混匀转染试剂，用50µLOpti-MEM稀释1.0µLLipofectamineTM2000，轻轻吹吸3-5次混匀，室温下静置5min。z混合转染试剂和siRNA稀释液，轻轻吹吸3-5次混匀，室温下静置20min。z转染复合物加入到24孔细胞板中，100µL/孔，前后轻摇细胞板混合均匀。z细胞板置于37oC、5%CO2培养箱中培养18-48hrs。转染4-6hrs后可换新鲜培养基。转染示意图：○1将siRNA/DNA和转染试剂分别用Opti-MEM稀释，5min后混合，室温放置20min○2将混合好的siRNAMix加入培养液中转染a：pRNAi-U6H1/Neo质粒转染BGC-823细胞48h后GFP表达荧光图b：PRNAI-CMV3.1/Neo质粒转染Hela细胞48h后GFP表达荧光图附表：各种细胞培养板转染推荐用量共用试剂DNA转染RNA转染培养容器培养面积铺板培养基稀释培养基DNA转染试剂RNA转染试剂96孔板0.3cm2100μL2×25μL0.2μg0.5μL5pmol0.25μL24孔板2cm2500μL2×50μL0.8μg2.0μL20pmol1.0μL12孔板4cm21mL2×100μL1.6μg4.0μL40pmol2.0μL6孔板10cm22mL2×250μL4.0μg10μL100pmol5.0μL60mm板20cm25mL2×0.50mL8.0μg20μL200pmol10.0μL10cm板60cm215mL2×1.50mL24μg60μL600pmol30.0μL4.3转染优化及注意事项：为了达到高的转染效率，在转染实验过程中，需要注意以下几点：1）纯化siRNA：在转染前要确认siRNA的大小和纯度。注意：化学合成的siRNA至少需要PAGE纯化，最好是HPLC纯化。2）避免RNase污染：微量RNase就会导致siRNA实验失败。由于实验环境中RNase普遍存在，如皮肤，头发，暴露在空气中的物品等。需要使用DEPC处理过的耗材及试剂，保证实验每个步骤不受RNase污染非常重要3）健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性：生长状态良好的对数生长期的细胞转染效率较高。此外，较低的传代数能确保每次实验稳定性。4）避免使用抗生素：推荐从细胞接种到转染后72小时期间避免使用抗生素。抗生素会在穿透的细胞中积累毒素。5）选择合适的转染试剂：针对siRNA制备方法以及靶细胞类型的不同，选择好的转染试剂和优化的操作对siRNA实验的成功至关重要。6）通过合适的阳性对照*优化转染和检测条件：对大多数细胞，看家基因（HouseKeepingGene）是较好的阳性对照。将不同浓度的阳性对照的siRNA转入靶细胞，转染48小时后统计对照蛋白或mRNA相对于未转染细胞的降低水平。*我们公司的阳性对照的种类（目录及页码）7）通过标记siRNA来优化实验：荧光标记的siRNA能用来分析siRNA稳定性和转染效率。AB 图：荧光标记的siRNA阴对照转染细胞转染效率图A：Hochest染色图B：FAM-siRNA转染结果图