搜索
实验前准备麻醉剂：水合氯醛（应较好的控制大鼠体温）保温：60W白炙灯高度为37cm直接照射能使肛温保持在37℃栓线的制备：1.取熔点为56℃的固体石蜡一块，在瓷杯中加热熔化。直径为o．24mm、长5cm的鱼线一端5mm长的一段，垂直在熔化的石蜡中迅速浸入并提起，立即凝固的一薄层石蜡可牢固地粘附在鱼线一端的表面，其直径为0.26mm。就这样，普通的鱼线即可变成规相一致头端光滑圆钝的栓线。2.在鱼线18mm的位置用涂改液标记一个白色点。TTC的配制：用0.2mol/L磷酸缓冲液（PBS）配成2%TTC溶液（pH7.5）,避光保存。体重与栓线直径：线栓直径0.24mm采用的SD大鼠，体重250-300g。实验方法：动物用10％水合氯醛（35mg/kg）腹腔注射麻醉。仰卧位固定，颈正中线切口，沿胸锁乳突肌内缘分离肌肉和筋膜，分离左侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA），在CCA远心端和近心端及ECA处挂线备用。用微动脉夹暂时夹闭ICA，然后近心端结扎CCA、ECA。然后在距CCA分叉部4mm处剪一小口，将拴线插入到ICA，这时用绕在CCA远心端的细线轻轻系牢拴线。（不可过紧，否则近线困难，但松了又会出血。）用眼科镊轻推拴线，从血管分叉处开始算距离，当插入深度在18mm时（一定要将血管放松至原来状态,且保证标记点在分叉处,由于标记的是白色的所以很容易看的），紧紧系牢CCA远心端的细线，此时的关键是动作轻柔，不要使ICA有任何的牵拉，否则栓线会脱出ACA，可能会造成缺血失败。血管外的栓线不要留得过长，更不要缝在皮外，大鼠醒来后会自己拔出。缝合伤口，单笼饲养观察。如果需要再灌的话，就把拴线抽出即可，因为脑底有个动脉环，结扎一侧颈总动脉大脑不会缺血的。注意事项：1．分离时要层次清楚：正中剪开SD大鼠颈部皮肤，分离皮下结缔组织时会发现该组织与颈部两侧鼓泡腺体（很多人误认为那是甲状腺）结合紧密，因此不必分离过于太细，直接在正中两侧鼓泡腺体之间分离，这样能不接触胸锁乳突肌而直接暴露颈前颈群且不会损伤腺体造成过多出血。下一步是分开颈前肌群，这时候要注意用小钳子作撑开分离动作要在左右肌肉块之间而不是一块肌肉的肌纤维之间，虽然它们看起来很模糊，但这样能保证不会出现较多条索状细肌纤维条影响下一步颈内动脉的寻找与分离，并且能整块地向一侧牵开颈前肌群暴露颈动脉鞘。见到颈动脉鞘了则要注意细致分离迷走神经，若损伤则可能影响其呼吸而死亡的。2.分离血管时，要尽量将血管剥离的干净些，这样在用眼科剪剪口时就不会误剪外膜（误剪的话再剪就很容易把口剪大了或者剪断了，要注意口子越小越好插线），且要剪一个斜行的切口（眼科剪与血管约成45度），这样在血液刚流出时仍能看上翻的断口管壁，这样即容易插入栓线且血管受得了插线时一定的牵拉。当然，切勿牵拉过猛，以免使血管发生痉挛，导致栓线不能顺利进入。3.注意尽量不要损伤在颈内颈外分叉下的交感神经节。4.如果你用的是中长效麻醉剂，插线成功后，固定丝线，然后让其俯卧位，而且稍稍抬高其颈部，才能确保模型成功。5.栓线进入后颈内动脉后即可逐渐插入了，有时候很顺利一插到底，但有时候在中间就怎么也进不去了，这是因为在血管入颅穿过颅骨时有一个狭窄或者角度。因此，碰上这种明显阻力时，一定不能盲目向前使力插，越插栓线前端变形越进不去且容易损伤血管。这时候正确的作法是往外抽出较多栓线，也许会有一定的动脉血流出，不必慌，只要顺着血管走行调整一下进线角度轻柔的使劲，一般都能进去，反复试几次还不行最好换根栓线，很可能前端也经变形角度变了！颈内动脉的走向为内上方,可以用眼科镊夹住鱼线插,但进去后要注意,别太用力,要不血管就要破了6.栓线不能在血管里反复进退，否则及容易造成蛛网膜下腔出血，，而且很容易误解为模型成功，因为这时的神经功能改变也很明显，但并不是由于栓塞引起的7.进线时，使栓线有一定程度的弯曲，且只要保证栓线向屋顶方向弯曲，一般都能将线插如颅内，决不会进入翼腭A。8.术后一定要注意保暖。9.插入线拴要轻柔熟练，速度尽可能快，以避免时间长了血管内血栓形成。10．手术后评分的主观因素很大，有用4分制和11分制的，我个人认为用4分制比较准些。其标准是：0分，无神经损伤症状;1分，手术对侧前指不能完全伸展；2分，向手术对侧行走；3分，大鼠成追尾状运动。11.性激素对脑梗死面积有较大影响，应采用单一性别的动物进行实验。舍去标准：⑴栓线插入深度不足18mm,且无明显神经功能缺损表现或症状很轻的大鼠⑵蛛网膜下腔出血、MCA起始部或其附近的willis环动脉有凝血块的大鼠，因为这是出血性脑损伤或永久性脑缺血损伤，而非MCAO/Reperfusion损伤。3）手术时出血较多，症状很重的动物。死亡原因分析：首先要找出死亡原因，解剖死亡大鼠的脑，先看是否有蛛网膜下腔出血，如有出血，表明死因是插线太深，以后注意插线深度；如无出血，则还要再看是否有严重的半球水肿，如水肿严重，则表明死因是脑缺血时间太重，需要缩短缺血时间；如既无出血，又无明显的脑水肿，那就要注意动物状态或生活环境是否太差。附带的其他说明：1..线拴法存在一定的死亡率。对于这情况我感觉比较头疼，也希望高手指点。2.模型成功率和评价指标是相关联的矛盾，手术后可根据动物的表现加以评分，确定模型是否成功，模型成功与否会对结果的评价带来影响。有可能你模型没成功，结果判断为是药物的作用效果。所以对手术后模型是否成功应该进行筛选的。另一方面，如果你做了预防给药，药效的作用也容易被认为是模型不成功，这也需要后边进行脑组织染色和组织血检查进行验证。脑组织检查时可剔除模型不成功以及SAH的个例。故实验在手术后要进行行为学评分，试验结束时应对脑组织进行组织学检查或染色。TTC染色是采用的宏观标本染色，确定梗死面积可采用体积法或面积法，但最好用扫描仪将脑组织切片进行扫描，选择合适的软件统计梗死面积。3.大鼠大脑中动脉永久性闭塞性脑缺血模型，梗死体积出现的最小时间点可能为2h，体积随时间进行性增大，至12h基本趋于稳定4.整个试验是很费动物的，存在15-30％的淘汰率（如果你做的好），但注意严格控制自己淘汰的动物（纪录具体情况）。5.除了刚才说的蛛网膜下腔出血外，还有一些老鼠肺出血明显，整个肺暗红，我也想不出原因，不知道是不是医学临床所说的脑肺综合症.6．在颈内和颈外之间常常会有一个交通支，其位置也不太相同，一定要万分小心，我曾经因为不知有这个交通支而勿将其破坏，导致大鼠出血不止