各种动物骨髓白细胞分离液试剂盒

北京索莱宝科技有限公司第1页共3页各种动物骨髓白细胞分离液试剂盒规格：200mL/kit保存：本产品对光敏感，应该室温避光储存，保质期2年。无菌开封后，保存于室温。试剂盒组成：各种动物骨髓白细胞分离液200mL细胞洗涤液200mL全血及组织稀释液200mL红细胞裂解液100mL操作步骤：1.制备骨髓的单细胞悬液。2.在离心管中加入适量分离液（细胞悬液体积小于5mL时，加入5mL分离液；大于等于5mL，加入等体积分离液。但二者的总体积不能超过离心管的三分之二，否则会影响分离效果），将细胞悬液平铺到分离液液面上方，注意保持两液面界面清晰。（可以使用巴氏德吸管吸取细胞悬液，然后将细胞悬液小心的平铺于分离液上，因为两者的密度差异，将形成明显的分层界面。如果样品较多，加样的时间较长，在离心之前出现红细胞成团下沉属正常现象。）3.室温，水平转子500~1000g，离心20~30min（细胞悬液的体积越大所需的离心力越大，离心时间越长，最佳的分离条件需摸索，离心转速最大不超过1200g）。4.离心后将出现明显的分层：最上层是稀释的稀释液层；稀释液与分离液之间是淋巴细胞层；分离液中为粒细胞层（个体差异或者是分离条件不同，粒细胞层可能分离不明显）；最下层为红细胞层。5.小心的吸取淋巴细胞层及分离液层细胞到15mL洁净的离心管中，10mLPBS或细胞洗涤液洗涤细胞。250g，离心10min（如有红细胞混杂则加入适量红细胞裂解液）分离示意图稀释液层红细胞层淋巴细胞粒细胞分离液层北京索莱宝科技有限公司第2页共3页6.弃上清，5mL的PBS或细胞清洗液重悬细胞，250g，离心10min。7.重复步骤68.弃上清，细胞重悬备用。骨髓单细胞悬液的制备方法小动物骨髓的采集：1.处死动物，无菌提取股骨和胫骨，剪去两端软骨，露出红色的骨髓腔（注意尽可能少的剪走骨髓腔）。2.取1ml的无菌注射器，吸取少量的含有10%标准胎牛血清的稀释液或者是含有血清的培养基，冲洗骨髓腔以获得骨髓。3.最终制备成2×108–1×109/ml的单细胞悬液备用。大动物骨髓的采集：大动物骨髓的采集可采取活体穿刺方法：先将动物麻醉、固定、局部除毛、消毒皮肤，然后估计好皮肤到骨髓的距离，把骨髓穿刺针的长度固定好。操作人员用左手把穿刺点周围的皮肤绷紧，右手将穿刺针在穿刺点垂直刺入，轻轻左右旋转将穿刺针钻入，当穿刺针进入骨髓腔时常有落空感。连接注射器缓慢抽吸骨髓组织，当注射器内抽到少许骨髓时即停止抽吸。用含10%标准胎牛血清的稀释液调整细胞浓度为2×108–1×109/ml的单细胞悬液备用。常用的骨髓穿刺点：股骨：穿刺部位在股骨内侧面,靠下端的凹面处；胸骨：穿刺部位是胸骨体与胸骨柄连接处；肋骨：穿刺部位是第5～7肋骨各点的中点；胫骨：穿刺部位是股骨内侧、靠下端的凹面处。如果穿刺采用的是肋骨，穿刺结束后要用胶布封贴穿刺孔，防止发生气胸。注意事项：A.开封前颠倒混匀，本分离液为无菌产品，为延长分离液保存时间，请在无菌条件下启封，避免微生物污染。。北京索莱宝科技有限公司第3页共3页B.分离液使用时应始终保持室温（18℃~25℃），如室内温度较低，可将分离液预热。4℃或者是温度较低的条件下离心，可能会导致白膜层中红细胞污染加重。C.稀释血液或洗涤细胞，不可使用含Ca、Mg离子的缓冲液及培养液，其成分会导致细胞凝集，大大降低细胞得率及纯度。D.部分塑料制品（如聚苯乙烯）因其带有的静电作用，可能会导致细胞挂壁，影响分离效果。E.样本的粘稠度或者是温度差异，可能会影响分离效果，可以调节离心转数和离心时间，摸索最佳的分离条件。F.如果要进一步对分离的细胞进行培养，那在收集血液和分离过程中，注意无菌操作，避免微生物污染。G.不同动物血液在不同比重分离液中的细胞离散系数及细胞带电不同，用户在制定分离液时应提供所需分离液的比重、动物种属及被分离细胞的名称。参考文献：1.BoyumA.Separationofleucocytesfrombloodandbonemarrow.ScandJClinLabInvestSuppl.1968;97:7.2.TingA,MorrisPJ.Atechniqueforlymphocytepreparationfromstoredheparinizedblood.VoxSang.1971Jun;20(6):561-3.3.BoyumA.SeparationofBloodLeucocytes,GranulocytesandLymphocytesTissueAntigens.1974;4(4):269-74.4.WeisbartRH,WebbWF,BluestoneR,GoldbergLS.Asimplifiedmethodforlymphocyteseparation.VoxSang.1972;23(5):478-80.5.RecaldeHR.Asimplemethodofobtainingmonocytesinsuspension.JImmunolMethods.1984Apr13;69(1):71-7.