各种动物骨髓干细胞分离液试剂盒

北京索莱宝科技有限公司第1页共4页各种动物骨髓干细胞分离液试剂盒货号:P8590规格：4×200ml/kit保存：室温避光储存，有效期至少2年。产品说明：全血及组织稀释液200ml细胞洗涤液200ml试剂C200ml试剂F200ml产品简介：分离液为FICOLL、羟乙基淀粉550与泛影酸葡甲胺的混合液。样本细胞在分离液中分层。离心时在FICOLL、羟乙基淀粉的作用下红细胞与粒细胞聚集并迅速沉降；此时干细胞仍处于分离液上层，红细胞污染可忽略不计。大部分血小板在细胞清洗低速离心过程中去除。其他人及动物多种比重细胞分离液，因不同种属不同比重分离液的细胞离散系数及细胞带电不同，用户在制定分离液时应提供所需分离液的比重、动物种属及被分离细胞的名称。适用于从动物骨髓中分离干细胞，无菌条件下所分离的干细胞可用于细胞培养等。本品仅供科研使用。试验中所需的仪器和试剂：可提供400g离心力的水平转子离心机、15ml玻璃离心管、吸管、胎牛血清等。注意事项：A．本实验要求，在正常大气压下，分离液、分离样本以及分离环境温度为20℃±2℃。分离液在低温时呈较高密度，在高温时呈较低密度。细胞分离液从冰箱取出后，不可立即使用，操作前可将样本和分离液复温至18-22℃。为获得最佳的实验结果，最好在获得样本后2小时内进行实验，存放时间越长细胞活性越低。北京索莱宝科技有限公司第2页共4页B．实验过程中，如需匀浆组织或洗涤细胞，不可使用含Ca、Mg离子的缓冲液及培养液，其成分会大大降低细胞得率及纯度。本公司生产的全血及组织稀释液和细胞洗涤液不含Ca、Mg离子、低内毒素水平且含细胞和保护成分，推荐使用。C．最优抗凝剂选择：EDTA、枸橼酸、肝素，其他抗凝剂也可使用，但会影响细胞活性。D．实验操作时，不可使用含粉手套、不可使用内毒素含量过高的液体，手套中的粉末颗粒及高内毒素会激活细胞从而降低细胞得率及活性。E．本实验不可使用高聚合材质（如聚苯乙烯）的塑料制品，其带有的静电作用将导致细胞贴壁影响分离效果。F．吸取过多的干细胞层及分离液层会导致分离液交界处的粒细胞被吸出从而使混杂的粒细胞数量增加。吸取过多的干细胞层上层溶液会导致血浆蛋白及血小板混杂。G．如需进行细胞计数，则样本贮藏时间不得多于10小时，否则将导致细胞被激活得率降低。H．为去除所混杂的血小板，可在分离液上层加上4-20%蔗糖梯度等渗溶液进行二次离心。I．细胞纯度可在步骤10后使用瑞氏染色方法确定，细胞活性可用台盼蓝处理后观察。J．适用半径15cm水平转子离心机。由于各品牌离心机的性能不同，国内南北地区温度环境和四季的差异，可能影响分离效果，用户可以调节离心转数和离心时间，摸索最佳的分离条件（具体分离条件各实验室自定）。操作方法：一、各种动物骨髓细胞的采集方法1.大鼠、小鼠骨髓的采集：用颈椎脱臼法处死动物，剥离出胸骨或股骨，用注射器吸取少量的F液，冲洗出胸骨或股骨中全部骨髓液，以500g（约1800转/分）离心20分钟，弃上清。沉淀以F液重复洗涤一次后用含20%胎牛血清的全血及组织稀释液悬起（细胞浓度为2×108-1×109个/ml），备用。2.大动物骨髓的采集：北京索莱宝科技有限公司第3页共4页A．骨髓穿刺点定位（1）胸骨：穿刺部位在胸骨中线,胸骨体与胸骨柄连接处，或选胸骨上1/3部。（2）胫骨：穿刺部位在胫骨内侧,胫骨上端的下方1厘米处。（3）肋骨：穿刺部位在第5～7肋骨各自的中点上。（4）髁骨：穿刺部位在髁前上棘后2～3厘米的髁嵴。（5）股骨：穿刺部位在股骨内侧面,靠下端的凹面处。B．骨髓穿刺方法（1）实验动物按要求固定，穿刺部位去毛、消毒、麻醉，要求局部麻醉范围直达骨膜，也可作全麻。（2）操作人员带消毒手套，确定穿刺点，估计从皮肤到骨髓的距离并依此固定骨髓穿刺针长度。左手拇、食指绷紧穿刺点周围皮肤，右手持穿刺针在穿刺点垂直进针，小弧度左右旋转钻入，当有落空感时表示针尖已进入骨髓腔。用左手固定穿刺针，右手抽出针芯，连接注射器缓慢抽吸骨髓组织，当注射器内抽到少许骨髓时立即停止抽吸，收集骨髓细胞加入4-5mlF液混匀，以500g（约1800转/分）离心20分钟，弃上清，沉淀以F液重复洗涤两次后用含20%胎牛血清的全血及组织稀释液悬起（细胞浓度为2×108-1×109个/ml），备用。（3）左手压住穿刺点周围皮肤，迅速拔出穿刺针，用棉球压迫数分钟。如穿刺的是肋骨，除压迫止血外，还需胶布封贴穿刺点，防止发生气胸。3.人骨髓的采集：临床方法收集骨髓细胞加入4-5mlF液混匀，以500g（约1800转/分）离心20分钟，弃上清，沉淀以F液重复洗涤两次后用含20%胎牛血清的全血及组织稀释液悬起（细胞浓度为2×108-1×109个/ml），备用。二、骨髓干细胞分离方法北京索莱宝科技有限公司第4页共4页1．取一支15ml离心管，加入3ml试剂C置于18-22℃。2．将样本小心加于C液之液面上。18-22℃，550g离心20-30分钟。低温（如4度）离心会降低细胞得率。3．离心后，用吸管小心吸出C液上层（包含干细胞的细胞层）0.5cm以上的上清液部分，弃去。4．用吸管小心吸取分离液层及干细胞层至于另一新离心管内。5．在步骤4中所得离心管中加入10ml细胞洗涤液混匀。250g离心10分钟。6．弃上清。用吸管以5ml细胞洗涤液重悬所得细胞，250g离心10分钟。7．弃上清。重复步骤6，后以0.5ml后续试验所需相应液体重悬细胞。