第五章-目的基因导入受体细胞

第五章目的基因导入受体细胞5.1受体细胞受体细胞(receptorcell)又称为宿主细胞或寄主细胞(hostcell)等，从实验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞；从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞。作为基因工程的宿主细胞必须具备以下特性：①便于重组DNA分子的导入；②能使重组DNA分子稳定存在于细胞中；③便于重组体的筛选；④遗传性稳定高，易于扩大培养或发酵生长；⑤安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物污染；⑥有利于外源基因蛋白表达产物在细胞内的积累，或促进外源基因的高效分泌表达。⑦在遗传密码的应用上无明显偏倚性；⑧具有较好的翻译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达；⑨在理论研究和生产实践上有较高的应用价值。基因工程中常用的受体细胞类型：原核生物细胞真核生物细胞真菌细胞植物细胞动物细胞原核生物细胞优点：1.大部分原核生物细胞无纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源DNA的进入。2.没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质，为外源DNA与裸露的染色体DNA重组减少了麻烦。3.原核生物多为单细胞生物，容易获得一致性的实验材料，并且培养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实验快。4.基因组小，遗传背景简单，并且不含线粒体和叶绿体基因组，便于对引入的外源基因进行遗传分析。缺点：1.原核生物细胞不具备真核生物的蛋白质折叠复性系统，即使真核生物基因能得到表达，得到的多是无特异性空间结构的多肽链。2.原核生物细胞缺乏真核生物的蛋白质加工系统，而许多真核生物蛋白质的生物活性正是依赖于其侧链的糖基化或磷酸化等修饰作用。3.原核细胞内源性蛋白酶易降解异源蛋白，造成表达产物不稳定。至今被用作受体菌的原核生物有大肠杆菌、枯草杆菌、蓝细菌等。一、大肠杆菌受体细胞大肠杆菌属革兰氏阴性菌，它是目前为止研究得最为详尽、应用最为广泛的原核生物种类之一，也是基因工程研究和应用中发展最为完善和成熟的载体受体系统。优点：繁殖迅速、培养简便，代谢易于控制。缺点：大肠杆菌细胞间隙中含有大量的内毒素，可导致人体热原反应。二、枯草杆菌受体细胞枯草杆菌又称枯草芽孢杆菌，是一类革兰氏阳性菌。优点：1.枯草杆菌具有胞外酶分泌－调节基因，能将具有表达的产物高效分泌到培养基中，大大简化了蛋白表达产物的提取和加工处理等，而且在大多数情况下，真核生物的异源重组蛋白经枯草杆菌分泌后便具有天然的构象和生物活性。2.枯草杆菌不产生内毒素，无致病性，是一种安全的基因工程菌。3.枯草杆菌具有芽孢形成的能力，易于保存和培养。4.枯草杆菌也具有大肠杆菌生长迅速、代谢易于调控、分子遗传学背景清楚等优点。应用：已成功的用于表达人的β干扰素、白细胞介素、乙型肝炎病毒核心抗原和动物口蹄疫病毒VPI抗原等。三、蓝细菌（蓝藻）蓝藻——又称蓝绿藻或蓝细菌，它含有叶绿素a(缺乏叶绿素b)和藻胆素，具有光合系统Ⅰ(PSⅠ)和光合系统Ⅱ(PSⅡ)、能进行光合作用，但它又具有细菌的特征，无细胞核及双层膜结构的细胞器，染色体裸露，是一种典型的原核生物。蓝藻作为表达外源基因的受体菌兼具微生物和植物的优点，具体表现在：基因组为原核型，除了裸露的染色体DNA外，不含叶绿体DNA和线粒体DNA，遗传背景简单，便于基因操作和外源DNA的检测。细胞壁属G－，主要由肽聚糖组成，便于外源DNA的转化。营光合自养生长，培养条件简单，只需光、CO2、无机盐、水和适宜的温度就能满足生长需要。多种蓝藻含内源质粒，为构建蓝藻质粒载体提供了极好的条件。蓝藻富含蛋白质，并且多数蓝藻无毒，早已用作食物或保健品，在此基础上采用转基因技术，把一些重要药物的基因转入无毒蓝藻，就可达到锦上添花的效果。真核生物细胞一、真菌受体细胞真菌是低等的真核生物，其基因结构、表达调控机制以及蛋白质的加工与分泌都具有真核生物的特征，因此利用真菌细胞表达高等动植物基因具有原核生物细胞无法比拟的优点。酵母菌细胞是单细胞真核微生物，外源真核基因最理想的表达系统。优点：1.酵母菌是结构最为简单的真核生物之一，其基因表达调控机理比较清楚，遗传操作相对比较简单。2.具有真核生物蛋白翻译后修饰加工系统。3.不含有特异性病毒，不产生毒素。4.培养简单，利于大规模发酵生产，成本低廉。5.能使外源基因表达产物分泌至培养基中，便于产物的提取和加工。二、植物受体细胞优点：全能性，即一个分离的活细胞在合适的培养条件下，较容易再分化成植株，这意味着一个获得外源基因的体细胞可以培养出能稳定遗传的植株或品系。缺点：植物细胞有纤维素参与组成的坚硬细胞壁，不利于摄取重组DNA分子。现在用作转基因受体的植物有水稻、棉花、玉米、马铃薯、烟草等经济作物和拟南芥等模式植物。三、动物受体细胞：优点：1.能识别和除去外源真核基因中的内含子，剪切和加工成熟的mRNA。2.真核基因的表达蛋白在翻译后能被正确加工或修饰，产物具有较好的蛋白质免疫原性，约为酵母细胞的16～20倍。3.易被重组DNA质粒转染，具有遗传稳定性和可重复性。4.经转化的动物细胞可将表达产物分泌到培养基中，便于提纯和加工，成本低。缺点：组织培养技术要求高，难度较大。目前用作基因转移的受体动物主要有猪，羊、牛、鱼等经济动物和鼠、猴等实验动物，主要用途在于大规模表达生产天然状态的复杂蛋白质或动物疫苗、动物品种的遗传改良及人类疾病的基因治疗等。常用的动物受体细胞有小鼠L细胞、Hele细胞、猴肾细胞和中国仓鼠卵巢细胞(CHO)等。以动物细胞，尤其是哺乳动物细胞作为受体细胞的优点。5.2.1重组质粒DNA分子转化大肠杆菌转化：重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称之为转化。转化现象最早是由Griffith于1928年在肺炎双球菌中发现的。5.2重组DNA分子转入原核生物细胞目录细菌转化的本质是受体菌直接吸收来自供体菌的游离DNA片段，即转化因子，并在细胞中通过遗传交换将之组合到自身的基因组中，从而获得供体菌的相应遗传性状的过程。以革兰氏阳性细菌为例，细菌转化的一种可能机制包括如下基本步骤：①细菌感受态的形成。当转化因子接近细菌细胞时．受体细胞分泌一种小分子质量的激活蛋白，又称为感受因子，能诱导使细菌胞壁部分溶解，局部暴露出细胞膜上的DNA结合蛋白和核酸酶等，此时细菌细胞处于感受态，极易接纳周围环境中转化因子以实现转化。②转化因子的吸收。受体菌细胞膜上的DNA结合蛋白可与转化因子的双链DNA结构持异性结合，然后激活邻近的核酸酶，将双链DNA分子中的一条链逐步降解，同时将另一条链逐步转移到受体菌内。③整合复合物前体的形成。进入受体细胞的单链DNA与另一种游离的蛋白因子结合，形成整合复合物前体，它能有效地保护单链DNA免受各种胞内核酸酶的降解，并将其引导至受体菌染色体DNA处。④单链DNA转化因子的整合。整合复合物前体中的单链DNA片段可以通过同源重组，置换受体细胞染色体DNA的同源区域．形成异源杂合双链DNA结构。⑤转化子的形成。受体菌染色体组进行复制，杂合区段亦随之进行半保留复制，当细胞分裂后，该染色体发生分离，形成一个新的转化子。大肠杆菌是一种革兰氏阴性菌，自然条件下很难进行转化，其主要原因是转化因子的吸收较为困难。在基因工程研究和应用中，转化受体菌细胞的正是根据人们需要构建的外源重组质粒DNA分子，而非来自供体菌的游离DNA片段(转化因子)。因此在大肠杆菌的转化实验中，很少采取自然转化的方法，通常的做法是首先采用人工的方法制备感受态细胞，然后进行转化处理，其中代表性的方法之一是Ca2+诱导的大肠杆菌转化法。（1）Ca2+诱导的大肠杆菌转化法Ca2+诱导DNA对大肠杆菌细胞的转化的可能原因：①在0℃的Cacl2低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，同时Cacl2使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，诱导大肠杆菌形成感受态。②Ca2+能与加入的DNA分子结合，形成抗DNA酶(DNase)的羟基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜的外表面上。当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，并随之出现许多间隙，为DNA分子提供了进入细胞的通道。该法重复性好。操作简便快捷，适用于成批制备感受态细胞。对这种感受态细胞进行转化，每μg质粒DNA可以获得5×106～2×l07个转化茵落，完全可以满足质粒的常规克隆的需要。Mg2+对DNA分子有很大的稳定性作用，因此利用Mgcl2与Cacl2共同处理大肠杆菌细胞，可以提高DNA的转化效率。如利用二甲基亚砜(DMSO)和二硫苏糖醇(DDT)等进一步处理细胞，能诱导高频感受态细胞的形成，转化效率可提高100～1000倍，且对大小质粒分子均可进行有效的转化。但该法要求条件高，对外界污染物极为敏感，通常很少采用。DNA分子进入大肠杆菌受体细胞的机制一般认为只有双链闭环或开环的质粒DNA分子才能转化，而线形DNA分子不能获得转化子。因此，环状DNA分子中混杂线形DNA分子，会影响环状DNA分子的转化效率。也有人认为吸附在受体细胞表面上的是双链DNA，但却以单链DNA进入细胞，这与革兰氏阳性菌的转化过程相似。转化处理过程中，可能感染杂菌，导致假阳性转化子的出现，因此须设以下几种对照处理：①DNA对照处理。转化处理液中用0.2ml无菌水代替0.2m1感受态细胞，检验DNA溶液是否染菌。②感受态细胞对照处理。转化处理液中用0.1mlNTE缓冲液代替0.1m1DNA溶液，检验感受态细胞是否染菌。③感受态细胞有效性对照处理。在0.2ml感受态细胞中加入0.1ml已知容易转化这种感受态细胞的质粒DNA。（2）电穿孔转化法基本原理：利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔(electroporation)．形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的有效吸收。电穿孔转化法的效率受电场强度、电脉冲时间和外源DNA浓度等参数的影响，通过优化这些参数，每ugDNA可以得到109－1010转化子。研究表明，当电场强度和脉冲时间的组合方式导致50％~70％细菌死亡时，转化水平达到最高。用于电穿孔转化法的细胞处理要比感受态细胞的制备容易得多．当细菌生长到对数中期后予以冷却、离心，然后用低盐缓冲液充分清洗降低细胞悬浮液的离子强度，并用10％甘油重悬细胞，使其细胞浓度为3×l010个／m1。分装，在干冰上速冻后置于－70℃贮存。这样，每小份细胞融解后即可用于转化，有效期达6个月以上。电穿孔转化须在低温下(0－4℃)进行，转化效率要比在室温下操作提高约100倍。（3）三亲本杂交接合转化大肠杆菌简称为三亲本杂交转移法，是基于非接合型质粒的迁移作用而建立的一种DNA转化方式．适用于那些难以采用Ca2+诱导转化法或电穿孔法转化的受体菌。非接合型质粒分子较小，缺少编码质粒转移体系所须的全部基因，不能象接合型质粒那样在宿主细胞间自我转移。但如果在宿主细胞中存在另外一种溶合性的接合型质粒（即辅助质粒），非接合型质粒通常也会被转移，这种由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程称为迁移作用。接合型质粒分子较大，自我转移的随意性强，转移过程中经常伴随着宿主细胞染色体的高频转移，因此难以作为基因工程载体使用。目前常用的质粒载体多是在非接合型质粒或缺失了接合转移基因的接合型质粒的基础上构建的，故重组质粒DNA分子也不能直接接进行接合转化．而只能通过其迁移作用来完成。首先将具有接合转化功能的辅助质粒转移至含有重组质粒的供体细胞中，然后将这种供体细胞与受体细胞进行混合，促使两者发生接合转化作用，将重组质粒导入受体细胞。整个接合转化过程涉及到3种有关的细菌菌株，即待转化的受体菌、含有要转化的重组质粒DNA的供体菌和含有广泛宿主的辅助质粒的辅助菌，因此称为三亲本杂交接合转化法。（4）转化率的计算及其影响因素转化率是指DNA分子转化受体菌获得转化子的效率，有两种表示方式：一是以转化子数与用于转化处理的DNA分子数或质量的比率表示；二是以转