浙江省分析测试科技计划项目

浙江省分析测试科技计划项目2007F700351竹笋中生氰糖苷的液相色谱测定技术研究项目实施工作总结一、项目基本情况生氰糖苷是一类由氰醇衍生物的羟基和D-葡萄糖缩合形成的糖苷,广泛存在于10000余种植物中。生氰糖苷类物质水解生成高毒性的氢氰酸,可引起成年人死亡剂量为每公斤体重0.5～3.5mg。台湾宜兰大学张永钟和孙璐西等人发现竹笋中含有氰糖苷类化合物。国际竹藤组织研究表明我国部分竹笋含有此类含氰糖苷，但尚未引起足够重视。我国是世界竹产业大国，拥有纯竹林面积420万公顷。由于不同竹种笋中氰化物含量差异很大，烹调方式也各不相同，若不对其食用安全性进行有效评估，则存在氰化物中毒风险。目前氰糖苷的定量测定方法主要是测定氰糖苷的降解产物氢氰酸，该方法主要采用蒸馏后产生氢氰酸，而后用水或者缓冲盐等物质吸收，再用碱滴定或者是比色法来测定氢氰酸，从而间接测得生氰糖苷的含量。上述方法，由于是测定降解产物，其一不能完全代表生氰糖苷的含量，其二滴定法和比色法易受植物体内物质干扰，结果偏差往往较大，不能真实反映植物体内氰糖苷的含量，且过程繁冗复杂。而生氰糖苷的定性研究则是建立在分析相应的配糖体和糖苷的基础上，推断得出可能的生氰糖苷的种类。但该方法效率低，时间长，且产生误差的可能性较大。因此，探索一种简便、快速，且能准确测定竹笋中生氰糖苷类物质的方法势在必行。本项目以竹笋为材料，采用色谱和色质联用技术对其含氰糖苷的种类和含量进行直接分析，并与传统的蒸馏滴定方法相比较，以其建立一套竹笋中生氰糖苷类物质新的简便、准确、可靠的定性定量方法，兼之以氰化物种类定性，针对竹笋中生氰糖苷类物质，为食品安全及质量控制奠定一定基础。二、项目执行情况2.1不同竹种竹笋中生氰糖苷的分光光度法定量研究为对浙江及周边地区竹笋中生氰糖苷总量进行初步研究，项目采用水蒸气蒸馏-分光光度法测定对苦竹、毛竹、雷竹等常见竹种竹笋中生氰糖苷进行了定量研究。并对市售水煮笋中生氰糖苷含量进行对比研究。2.1.1苦竹笋中氰化物含量浙江省分析测试科技计划项目2007F700352据报道，苦竹笋中含有酪氨酸酶抑制活性的氰苷。虽然苦竹具有很强的苦味，但部分地区仍存在食用现象。采集未出土以及出土的苦竹笋，避光密封冷冻保存。因未出土苦竹笋较小，测定时采用了整根竹笋全部粉碎的方法。由表1的测定结果可知，苦竹笋中氰化物含量因产地的不同而有差别。实验对每个笋样平行测定三次，取平均值作为测定结果。并采用添加回收率结果表征实验的准确度。采于福建及亚林所苦竹笋含量约为0.81及0.72µg/g。而采于浙江林学院的苦竹笋中氰化物含量较高，平均值为3.02µg/g。结果较文献偏低，可能是由于种类、区域不同或用作分析的笋尖样本占整个竹笋的比例不同。表1未出土苦竹笋中氰化物含量测定结果123平均值（µg/g)相对标准偏差（%）亚林所（µg/g)0.760.690.710.723.97浙江林学院(µg/g)2.953.023.103.022.03福建(µg/g)0.840.780.800.813.09空白添加回收率（%）98.5本工作还对未出土以及出土苦竹笋中氰化物含量进行了比较。为了便于采样，实验采用亚林所样用于研究光对氰化物稳定性的影响。结果如表2所示。出土见光样氰化物平均含量为0.17µg/g，而未出土样中氰化物平均含量为0.72µg/g，说明随着苦竹笋的生长，出土的苦竹笋中氰化物的含量会大幅度降少，降低近80%。表2出土及未出土苦竹笋中氰化物含量123平均值（µg/g)相对标准偏差（%）出土（µg/g)0.160.170.180.174.80未出土（µg/g)0.760.690.710.723.97空白添加回收率（%）97.82.1.2毛竹笋中氰化物含量毛竹笋是较常食用笋种，分为冬笋（未出土）和春笋（出土），本工作针对浙江省分析测试科技计划项目2007F700353冬笋和春笋中氰化物含量进行了研究，结果表明（表3），冬笋中氰化物含量为1.40µg/g，而春笋中氰化物平均含量为1.21µg/g，差别并不明显，即见光对氰化物稳定性影响不大，这与苦竹的情况有所不同。原因可能是毛竹笋尖外壳颜色较深，起到了避光的作用，氰化物可稳定存在。而苦竹笋外皮呈较浅绿色，无法起到避光作用，从而导致出土与未出土结果差别较明显。2.1.3雷竹笋中氰化物含量雷竹出笋早，出笋期长，是一种优良的笋用竹种。对未出土雷竹笋氰化物含量测定结果为1.65µg/g,说明雷竹笋中含有一定量生氰糖苷。表3出土及未出土毛竹笋中氰化物含量123平均值（µg/g)相对标准偏差（%）出土（µg/g)1.261.171.201.213.09未出土（µg/g)1.351.461.391.403.25空白添加回收率（%）99.22.1.4水煮笋中氰化物含量生氰糖苷具有不稳定性，可通过水煮的方式破坏其结构。研究考察了市售水煮笋及汤汁中氰化物的含量，如表4所示。结果表明，市售几种水煮笋中氰化物含量处于可安全食用水平。与水煮笋相比，汤汁中氰化物含量略高（表5），但亦处于可安全食用较低水平。表4水煮笋中氰化物含量样品名称称样量（g)氰化物含量（ug/g)水煮高山野笋20.710.08水煮雷笋20.400.10水煮冬笋25.920.05表5水煮笋汤汁中氰化物含量样品名称称样量（g)氰化物含量（ug/g)水煮高山野笋汤汁25.00.08水煮雷笋汤汁15.00.14水煮冬笋汤汁15.00.12浙江省分析测试科技计划项目2007F700354竹笋是人们较常入菜的一种植物，常见笋种氰化物含量的分析具有重要意义。可引起成年人死亡的氰化物剂量为每公斤体重0.5～3.5mg，依本文研究结果，不论是含量最高为3.02µg/g的苦竹笋，还是氰化物含量较低的毛竹冬笋和雷竹冬笋（分别为1.40及1.65µg/g），氰化物含量均处于相对较安全水平。作为主要加工方式，水煮笋及汤汁中含量相对更低。因此只要在食用前经水煮等高温处理，大部分竹笋可安全食用。2.2竹笋中生氰糖苷的提取方法的研究苦杏仁苷（结构式1）是常见生氰糖苷中一种。其结构与已报道苦竹笋中生氰糖苷结构式（结构式2）较相似。因此本研究采用苦杏仁苷为内标物探讨了生氰糖苷提取溶剂的选择。结构式1结构式2采用亚林所苦竹，苦杏仁苷加标回收，分光光度法定量分析，研究了提取溶剂对提取效果的影响。依据参考文献，实验考察了100%甲醇，70%甲醇，60%甲醇，100%乙醇，70%乙醇，60%乙醇料液比为1：10时浸提12h的提取效果，结果（见表6）表明70%甲醇具有较佳提取效果，但提取率仅58.33%。乙醇提取效果较差是因为生氰糖苷不溶于冷乙醇。表6不同提取溶剂的浸提效果称样量（g)提取溶剂氰化物含量（ug/g)氰化物提取率（%）10.00100%甲醇0.3143.0610.0070%甲醇0.4258.3310.0060%甲醇0.3345.8310.00100%乙醇0.1926.3910.0070%乙醇0.2230.5610.0060%乙醇0.2534.72浙江省分析测试科技计划项目2007F700355在浸提实验基础上，本研究考察了索氏提取对氰苷的提取效果。实验采用100%甲醇、70%甲醇、100%乙醇、70%乙醇为提取溶剂，考察了索氏提取8h的提取效果。结果表明：70%甲醇为提取溶剂较好，但四种溶剂提取效果差别不大。表7索氏提取溶剂对提取效果的影响称样量（g)提取溶剂氰化物含量（ug/g)氰化物提取率（%）10.00100%甲醇0.6184.7210.0070%甲醇0.6590.2810.00100%乙醇0.6286.1110.0070%乙醇0.6387.50另本文参考文献，考察了甲醇与三氯甲烷混合溶剂的提取效果。结果表明，甲醇：三氯甲烷=4：6的混合溶剂提取效果较佳，提取率可达95.83%。但三氯甲烷为易制毒试剂，因此本研究最终采用70%甲醇作为提取溶剂。2.3竹笋中生氰糖苷液相色谱分析方法的建立以2g苦杏仁样品（经水蒸气蒸馏-分光光度法测定，氰化物含量3.78ug/g，相当于苦杏仁苷含量为66.50ug/g）为研究对象，经75%甲醇提取，定容至25mL,液相色谱进样测试。测试条件：C18色谱柱(5um,150mm*46mm)；流动相甲醇：水=3：7；流速1ml/min；DAD检测器；波长范围210-290nm。标样色谱图分别如图1和图2所示。而样品却未检出。说明样品含量可能低于检出限。由分光光度法检测结果可知，竹笋中氰化物含量更低，这可能造成竹笋样品中生氰糖苷亦无法检出。由图3及图4，可看出色谱图中没有明显的色谱峰，亦可说明此观点。而且据报道的苦竹笋中生氰糖苷标样价格极其昂贵，约10000元/5mg,这就使得液相色谱方法不但在检出限，更在测定成本上具有较大局限性。AU0.000.020.04分钟0.002.004.006.008.0010.0012.0014.00图1109ug/mL苦杏仁苷标样色谱图浙江省分析测试科技计划项目2007F7003560.0000.0050.0100.0150.0200.0250.0300.0350.0400.0450.0500.0550.060AU0.001.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.0011.0012.0013.0014.0015.00分钟250.00300.00350.00400.00图2109ug/mL苦杏仁苷标样三维色谱图AU0.000.050.10分钟0.002.004.006.008.0010.0012.0014.00图3检测波长为231nm苦竹样品的色谱图AU0.000.020.04分钟0.002.004.006.008.0010.0012.0014.00图4检测波长为274nm苦竹样品的色谱图2.4气相色谱-质谱联用仪测定水解产物醛类，用以对竹笋生氰糖苷定性、定量。浙江省分析测试科技计划项目2007F700357因前述，液相色谱方法具有较大局限性，加之液相色谱-质谱同样需要标样才能达到定性、定量的特点，本研究转变研究思路，采用气相色谱-质谱联用仪对竹笋生氰糖苷进行定性、定量。利用生氰糖苷类物质酸性条件下易水解，且水解最终产物为醛类的特性，通过对醛类物质进行定性和定量研究，从而对生氰糖苷类物质进行定性。这样就不必购买昂贵的氰苷标样，只需具备常见的醛类就可对氰苷进行初步定性，并且进行定量。固相微萃取是一种特殊的顶空装置，采用针头涂敷的吸附剂，对达到气液平衡的气体成分进行吸附后，在气相色谱高温进样口进行解吸，通过质谱分析即可定性定量，是集萃取、浓缩、解吸于一体的样品前处理技术。与传统方法相比，固相微萃取具有方便，快捷，样品用量少，不使用有机溶剂等特点。而且生氰糖苷类物质水解产生剧毒氰化氢，而在密闭条件下进行的固相微萃取可避免毒性物质的泄露。待萃取完成后，可向密闭容器中加入过量的碱液，吸收氰化氢，再进行响应处理即可。2.4.1水解条件的确定生氰糖苷在酸性条件下水解产生醛类物质，为了确立合适的水解条件，以适合固相微萃取，分别考察了4mol/L硫酸、3mol/L盐酸对水解产物的影响。实验过程如下：称取苦杏仁1.00g,加入4mL酸，在沸水中加热15min，60℃烘箱中，加热10min，萃取头萃取20min，在气相色谱进样口解析1min，利用气相色谱-质谱联用仪标准谱图库对色谱图进行定性分析。因为盐酸具有一定挥发性，因此在固相微萃取过程中会有氯化氢被萃取。这样不仅增加样品基质复杂性，而且对色谱柱具有一定损害，因此本研究最后采用4moL/L硫酸作为水解酸。色谱图及质谱图见图5和图6。水解产物苯甲醛质谱图与标准谱图匹配率达97%，可确定是苯甲醛，因此采用固相微萃取对生氰糖苷进行定性具有一定可行性。在此基础上，采用外标法（关系曲线见图7）对苦杏仁中样品生氰糖苷进行了定量研究，生氰糖苷含量为60.71ug/g，与分光光度法一致，说明固相微萃取方法可用于对样品生氰糖苷进行定量研究。浙江省分析测试科技计划项目2007F7003581.502.002.503.003.504.0