乙肝表面抗原吖啶酯化学发光定量免疫分析方法的建立

乙肝表面抗原吖啶酯化学发光定量免疫分析方法的建立欧赛英１，潘杨滨１，陈秀发１，沙利烽１，梁　辰２，冯　杰２，薛　辉２，颜光涛２（１．苏州长光华医生物试剂有限公司，江苏苏州２１５１６３；２．中国人民解放军总医院医学检验中心，北京１００８５３）ＤＯＩ：１０．１１７４８／ｂｊｍｙ．ｉｓｓｎ．１００６－１７０３．２０１９．０６．０３７收稿日期：２０１８０８３０；修回日期：２０１８１２１０通讯作者：颜光涛，研究员。研究方向：标记免疫分析技术。Ｅｍａｉｌ：[e-mail]摘要：目的　建立一种定量检测乙肝表面抗原（ＨＢｓＡｇ）的化学发光免疫分析方法并评估其性能。方法　利用双抗体夹心法实验原理，用吖啶酯标记多抗，用生物素标记两株单抗，通过磁颗粒链霉亲和素生物素系统分离固相和液相完成检测。结果　本方法的检测限为０．０５ＩＵ／ｍＬ，线性范围为０．０５～１５０ＩＵ／ｍＬ，可溯源至国际标准品，批内变异小于５％，总变异小于８％，浓度高达１０６ＩＵ／ｍＬ的强阳样本未出现ＨＯＯＫ效应；５套阳转盘对雅培Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ、西门子ｃｅｎｔａｕｒ和强生ＶＩＴＲＯＳ发光试剂相对敏感系数分别是３、０、－３；国家参考盘检出达标；与雅培Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ比较，２０００例临床样本检测灵敏度为９９．７７％，特异性为１００％，一致性达９９．９５％。结论　本研究建立的ＨＢｓＡｇ定量检测试剂，各项指标均满足临床检测的要求，灵敏度高，特异性好，适合临床推广应用。关键词：乙肝表面抗原；　链霉亲和素生物素；　化学发光免疫分析（ＣＬＩＡ）；　酶联免疫分析（ＥＬＩＳＡ）ＴｈｅＥｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆＡｃｒｉｄｉｎｉｕｍＥｓｔｅｒｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙＭｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＨｅｐａｔｉｔｉｓＢＳｕｒｆａｃｅＡｎｔｉｇｅｎＯＵＳａｉｙｉｎｇ，ＰＡＮＹａｎｇｂｉｎｇ，ＣＨＥＮＸｉｕｆａ，ＳＨＡＬｉｆｅｎｇ，ＬＩＡＮＧＣｈｅｎｇ，ＦＥＮＧＪｉｅ，ＸＵＥＨｕｉ，ＹＡＮＧｕａｎｇｔａｏ（ＳｕｚｈｏｕＨｙｂｉｏｍｅＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｃｏ．，ＬＴＤ，Ｓｕｚｈｏｕ２１５１６３，Ｃｈｉｎａ；ＭｅｄｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙＣｅｎｔｅｒ，ＰＬＡＧｅｎｅｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００８５３，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｆｏｒＨｅｐａｔｉｔｉｓＢｖｉｒｕｓｓｕｒｆａｃｅａｎｔｉｇｅｎ（ＨＢｓＡｇ）ａｎｄｅｖａｌｕａｔｅｉｔｓｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ．ＭｅｔｈｏｄｓＡｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｐｒｉｎｃｉｐｌｅｏｆｄｏｕｂｌｅａｎｔｉｂｏｄｙｓａｎｄｗｉｃｈ，ａｎｔｉＨＢｓＡｇｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｗａｓｌｉｎｋｅｄｗｉｔｈａｃｒｉｄｉｎｉｕｍｅｓｔｅｒ，ａｎｄｔｈｅｏｔｈｅｒｔｗｏｓｔｒａｉｎｓｏｆａｎｔｉＨＢｓＡｇｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｗｅｒｅｌｉｎｋｅｄｗｉｔｈｂｉｏｔｉｎ，ａｎｄｍａｇｎｅｔｉｃｂｅａｄｓｗｅｒｅｃｏａｔｅｄｂｙｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ．Ｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｗａｓｃａｒｒｉｅｄｏｕｔｖｉａｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎｂｉｏｔｉｎｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍａｎｄｗａｓｈｉｎｇｐｒｏｃｅｓｓ．ＲｅｓｕｌｔｓＴｈｅｌｉｍｉｔｏｆｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｗａｓ０．０５ＩＵ／ｍＬ，ａｎｄｔｈｅｌｉｎｅａｒｒａｎｇｅｗａｓ０．０５１５０ＩＵ／ｍＬ，ａｌｓｏｔｈｅｉｎｔｒａｂａｔｃｈａｎｄｔｏｔａｌｖａｒｉａｔｉｏｎｗａｓｌｏｗｅｒｔｈａｎ５％ａｎｄ８％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＮｏＨＯＯＫｅｆｆｅｃｔｗａｓｏｂｓｅｒｖｅｄｉｎｓｔｒｏｎｇｐｏｓｉｔｉｖｅｓａｍｐｌｅｓｗｉｔｈａｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ１０６ＩＵ／ｍＬ．Ｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓｏｆｔｈｅ５ｓｅｒｏｃｏｎｖｅｒｔｉｏｎｐａｎｅｌ，ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＡｂｂｏｔｔＡｒｃｈｉｔｅｃｔ，ＳｉｅｍｅｎｓＣｅｎｔａｕｒａｎｄＪｏｈｎｓｏｎＶＩＴＲＯＳｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔｒｅａｇｅｎｔｓ，ｗｅｒｅ３，０ａｎｄ３，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｎａｔｉｏｎａｌｒｅｆｅｒｅｎｃｅｐｌａｔｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｃｏｎｆｏｒｍｔｏｔｈｅｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ．ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＡｂｂｏｔｔＡｒｃｈｉｔｅｃｔＨＢｓＡｇｋｉｔ，ｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙａｎｄｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｏｆｔｈｅ２０００ｃｌｉｎｉｃａｌｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅ９９．７７％，１００％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａｎｄｔｈｅｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙｗａｓ９９．９５％．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＴｈｅＨＢｓＡｇｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｔｅｓｔｒｅａｇｅｎｔｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙｍｅｅｔｓｔｈｅｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓｏｆｔｈｅｃｌｉｎｉｃａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ｗｉｔｈｈｉｇｈｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙａｎｄｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，ａｎｄｉｓｓｕｉｔａｂｌｅｆｏｒｃｌｉｎｉｃａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＨｅｐａｔｉｔｉｓＢＶｉｒｕｓｓｕｒｆａｃｅａｎｔｉｇｅｎ（ＨＢｓＡｇ）；　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎａｄｖｉｎｂｉｏｔｉｎ；　Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（ＣＬＩＡ）；　Ｅｎｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）２５０１ＬａｂｅｌｅｄＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ＆ＣｌｉｎＭｅｄ，Ｊｕｎ．２０１９，Ｖｏｌ．２６，Ｎｏ．６　　慢性乙型肝炎（乙肝）病毒（ｈｅｐａｔｉｔｉｓＢｖｉｒｕｓＨＢＶ）感染可导致肝硬化和肝细胞癌等严重后果，从而带来巨大的社会经济负担，已成为全球公共卫生问题。根据ＷＨＯ公布数据，目前，全球６０亿人口中约有２０亿感染过ＨＢＶ，其中３．５亿为慢性感染者，每年约有７８万人死于ＨＢＶ相关性肝硬化和肝癌［１］。根据ＨＢＶ基因组差异性大于８％，ＨＢＶ被分成１０种基因型（Ａ～Ｊ）及４０种不同的亚基因型，不同基因型ＨＢＶ流行病学特征不同［２］。ＨＢｓＡｇ是ＨＢＶ感染后首先出现的血清标志物，预示价值高，是目前临床上应用最多的血清标志物，也是ＷＨＯ公认的判断ＨＢＶ感染的关键指标。随着检测技术的不断发展，临床检测和血筛市场对灵敏度的要求也越来越高，目前全球有多达上百个相关检测产品，包括酶联免疫法、胶体金标记法、化学发光等分析方法，以化学发光法的灵敏度为最佳［３］。高灵敏度、高特异性、以及定量检测是ＨＢｓＡｇ检测的三大趋势。本文根据化学发光免疫定量分析的原理，采用吖碇酯标记分析技术，用双抗体夹心法建立检测人血清／血浆中ＨＢｓＡｇ含量的方法，现将试验结果报道如下。材料和方法　　１　材料　　１．１　试验仪器及主要试剂　吖碇酯和生物素购自Ｓｉｇｍａ公司；乙肝表面抗原单抗和多抗购自Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ公司；ＨＢｓＡｇ国际校准品（ＮＩＢＳＣｃｏｄｅ：１２／２２６）购自ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｅｆｏｒＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＳｔａｎｄａｒｄａｎｄＣｏｎｔｒｏｌ；ＨＢｓＡｇ国家参考盘购自中检所；阳转盘购自ＢＢＩ公司；对照试剂为雅培ＡｒｃｈｉｔｅｃｔＨＢｓＡｇ定量检测试剂盒。全自动化学发光分析仪由苏州长光华医生物工程有限公司研发生产。　　１．２　标本来源　１０００例阴性样本：来自医院体检样本，并且Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ检测结果均为阴性。医院日常检验样本：２０００例，含２５０例干扰样本（２００例孕妇血、１０例类风湿样本、１０例ＡＮＴＩＨＡＶ、１０例梅毒、１０例ａｎｔｉＣＭＶ、１０例酒精肝），经对照试剂检测过，冷冻于－２０°Ｃ保存。　　２　方法　　２．１　操作方法　本方法采用两步法模式（洗涤两次）进行操作。第一步反应：将样本和生物素化乙型肝炎病毒表面抗体（ＡｎｔｉＨＢｓ）进行反应，如果标本中含有ＨＢｓＡｇ，将形成抗原抗体复合体，加入链霉亲和素包被的微粒，复合体在生物素和链霉亲和素相互作用下形成固相。随后将反应液置于一个磁场内，检测中的磁微粒将被吸附，通过洗涤，将未结合物冲洗除去。第二步：加入吖啶酯标记的ＡｎｔｉＨＢｓ，与磁颗粒上的ＨＢｓＡｇ复合物反应，通过洗涤，将未结合物冲洗除去。然后，注入化学发光缓冲液１和２，检测其化学发光光子强度；产生的光强度与样本内ＨＢｓＡｇ浓度成正比。　　２．２　生物素标记抗体的制备　取两株ＨＢｓＡｇ单抗按１∶１０～１∶２０的摩尔比混合，采用０．０５ｍｏｌ／ＬｐＨ９．５ＣＢ调整浓度为１ｍｇ／ｍＬ；按抗体∶生物素＝１∶１０～１∶２０摩尔比边搅拌边混合，室温反应０．５～１．５ｈ；透析纯化至少３次去除多余生物素和小分子，加入等量甘油，放置－２０℃保存。　　２．３　吖碇酯标记抗体的制备　取一定量ＨＢｓＡｇ多抗，采用０．０５ｍｏｌ／ＬｐＨ９．５ＣＢ调整浓度为１ｍｇ／ｍＬ；按抗体：吖啶酯＝１∶１０～１∶２０摩尔比边搅拌边混匀，室温反应０．５～１．５ｈ；透析纯化至少３次去除多余小分子，加入等量甘油，放置－２０℃保存。　　２．４　发光激发缓冲液１、２的配制　激发液１为０．１ｍｏｌ／ＬＨＮＯ３溶解１％过氧化氢；激发液２为０．１ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ。此激发液１、２配制完毕后密封于２～３０℃避光保存。　　２．５　试剂盒优化　通过基础缓冲液选择、样本加样量选择、抗体稀释度和体积的选择、反应步骤选择、反应时间的选择对体系进行优化。　　３　方法学评价　　３．１　检测限（ｌｉｍｉｔｏｆｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，ＬｏＤ）　参考ＣＬＳＩＥＰ１７Ａ，检测１０００例阴性样本（Ｂ）的发光值；另外检测５个连续浓度梯度极低浓度样本（Ｓ），每天重复４次，连续测５ｄ。根据公式ＬｏＤ＝μＢ＋１．６４５σＢ＋１．６４５σｓ，其中μＢ表示阴性样本发光平均值，σＢ表示阴性样本标准差，σｓ表示低浓度样本标准差，计算出检测限的发光值，将此发光值代入标准曲线，得出的浓度值即检测限。　　３．２　剂量反应曲线　参考ＣＬＳＩＥＰ６Ａ２，将接近线性范围浓度上限的高值样本，稀释６个浓度梯度至接近下限。用最小二乘法将测定结果（３次平均值）和稀释比例进行线性拟合，计算线性相关系数ｒ。３５０１标记免疫分析与临床　２０１９年６月第２６卷第６期　　３．３　标准品的溯源［４］　将第三代国际校准品１２／２２６用１ｍＬ纯水复溶。之后用阴性人血浆为基质液配置ＨＢｓＡｇ浓度为０、０．０５、０．５、１、５、１０ＩＵ／ｍＬ的校准品。混合５份以上高浓度阳性样本，用阴性人血浆梯度稀释。用国际校准品对公司校准品进行赋值。赋值后的公司校准品定标检测国际校准品（２、１、０．５、０．２５、０．１２５、０．０６２５、０．０３１３ＩＵ／ｍＬ），观察国际校准品的理论值与测值偏差。　　３．４　精密度　采用三批次试剂，对５份样本（其中３份高中低质控品，２份为校准品），每天上下午各检测一次，每次双孔，共进行２０ｄ。　　３．５　ＨＯＯＫ效应　用本方法对ＨＢｓＡｇ浓度高达１０６ＩＵ／ｍＬ的样本倍比稀释至１５０ＩＵ／ｍＬ，双孔测定并分析发光值与浓度值的关系，判定试剂是否出现ＨＯＯＫ效应。　　３．６　国家参考品盘　检测ＨＢｓＡｇ国家参考品盘，包括３份阳性参考品，２０份阴性参考品及９份灵敏度参考品。　　７．７　诊断灵敏度　采用本方法对５套阳转血清盘进行检测，根据检测结果，并参照ＷＨＯ对阳转血清相对灵敏度系数的计算方法来评估对ＨＢＶ早期感染的能力进行评价。相对灵敏度系数是评价试剂对窗口期样本检测能力的指标。计算方法为：对每一个阳转盘，将对照试剂检出的第一份系列血清定为０，将待评价试剂检测结果与其做对比，确定待评价试剂检出的第一份系列血清与参比试剂的０血清的位置关系。对任一阳转血清盘而言，若待评价试剂检出的第一份阳性样本在参比试剂０血清前２位，则记为－２；反之，若在参比试剂０位置的后３位，则相对敏感系数为＋３。如此类推，对全部阳转