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研究用CodeNo.6110A说明书PrimeScript™1stStrandcDNASynthesisKitv201606Da目录内容页码●制品说明1●制品内容1●本Kit以外需准备的主要试剂及仪器1●保存1●1stStrandcDNA合成反应1●RT-PCR及RealTimeRT-PCR反应2●注意事项2●关联产品3-1-●制品说明本制品是使用PrimeScriptRTase从TotalRNA或PolyA+RNA合成1stStrandcDNA的试剂盒，含有1stStrandcDNA合成所需的全部试剂。PrimeScriptReverseTranscriptase是一种MMLV(MoloneyMurineLeukemiavirus)由来的新型反转录酶。本酶能够有效合成长达12kb的1stStrandcDNA，即使对富含GC的片段或者具有复杂二级结构的RNA，在常规的反转录温度42℃条件下也能得到良好的反转录效果，无需进行高温反转录反应（高温反转录反应会导致RNA的降解）。合成的1stStrandcDNA可广泛应用于2ndStrand合成、杂交、PCR扩增、RealTimePCR反应等。●制品内容（50次量）1.PrimeScriptRTase（200U/μl）50μl2.5×PrimeScriptBuffer200μl3.RNaseInhibitor（40U/μl）25μl4.dNTPMixture（10mMeach）50μl5.OligodTPrimer（50μM）50μl6.Random6mers（50μM）100μl7.RNasefreeH2O1ml【引物序列】*该序列和TaKaRaRNAPCR™Kit(AMV)Ver.3.0(CodeNo.RR019A/B)的OligodTAdaptorPrimer不同，不含有M13PrimerM4匹配的序列。●本Kit以外需准备的主要试剂及仪器1.水浴锅2.DNA扩增仪TaKaRaPCRThermalCyclerDice™Gradient(CodeNo.TP600)。3.电泳用凝胶AgaroseL03[TAKARA](CodeNo.5003),PrimeGel™AgarosePCR-Sieve(CodeNo.5810A),etc.4.电泳仪5.微量离心机6.微量移液器和枪头（高压灭菌）●保存：-20℃。●1ststrandcDNA合成反应1.按下表配制反应液：试剂使用量OligodTPrimer（50μM）[或Random6mers（50μM）]1μl或1μl（0.4-2μl）*1dNTPMixture（10mMeach）1μlTemplateRNAtotalRNA：5μg*2PolyA+RNA：1μgRNasefreedH2Oupto10μl引物名称各引物序列Random6merspd(N)6OligodTPrimerTakara特别开发的dT序列*-2-2.65℃保温5min后，冰上迅速冷却。*33.按下表配制20μl反应液：试剂使用量上述变性后反应液10μl5×PrimeScriptBuffer4μlRNaseInhibitor（40U/μl）0.5μl（20units）PrimeScriptRTase（200U/μl）1μl（200units）RNasefreedH2Oupto20μl4.缓慢混匀。5.按下列条件进行反转录反应：30℃10min.（使用Random6mers时）42℃（50℃）*430-60min.6.95℃保温5min.*5使酶失活，冰上放置。*1：为获得良好的实验结果，2kb以上的长片段cDNA合成时，Random6mers的使用量为0.4μl（20pmol），RealTimePCR反应时，Random6mers的使用量为2μl(100pmol)。也可以使用GeneSpecificPrimer，此时引物终浓度为0.1μM。*2：RealTimeRT-PCR反应时，TotalRNA的使用量不超过1μg。*3：模板RNA的变性步骤对于提高反转录效率很重要。*4：通常情况下在42℃进行反转录反应。但当反转录引物使用PCR的下游引物时，为了减少由于引物错配等引起的非特异性扩增，将反转录温度设为50℃。*5：长片段cDNA扩增时，为了保证1ststrandcDNA的完整性，请进行70℃、15min.失活处理。●RT-PCR及RealTimeRT-PCR反应1stStrandcDNA合成反应液无需纯化，可以直接作为PCR、RealTimePCR反应用的模板。但是1stStrandcDNA合成反应液的添加量不要超过PCR反应体系的1/10。模板量会影响酶的扩增效率。因此需参照PCR酶的操作方法选择合适的模板量。若PCR扩增后有非特异性条带或者没有扩增产物，将cDNA合成反应液用RNaseH处理可改善PCR扩增结果。1.推荐使用的PCR酶。高扩增效率：TaKaRaExTaq®,TaKaRaExTaqHS长链DNA扩增：TaKaRaLATaq®,TaKaRaLATaqHS,PrimeSTAR®GXLDNAPolymerase高保真PCR扩增：PrimeSTARHSDNAPolymerase,PrimeSTARGXLDNAPolymerase,PrimeSTARMaxDNAPolymerase2．RealTimePCR相关试剂。SYBR®GreenI方法检测试剂：SYBRPremixExTaq™（TliRNaseHPlus）SYBRPremixExTaqII（TliRNaseHPlus）探针方法检测试剂：PremixExTaq（ProbeqPCR）,ProbeqPCRMix●注意事项RNA的纯度会影响cDNA的合成量，而制备RNA的关键是要抑制细胞中的RNA分解酶和防止所用器具及试剂中的RNA分解酶的污染。因此，在实验中必须采取以下措施：戴一次性干净手套；使用RNA操作专用实验台；在操作过程中避免讲话等等。通过以上办法可以防止实验者的汗液、唾液中的RNA分解酶的污染。-3-【使用器具】尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前按下列方法进行处理。（1）干热灭菌（180℃，60min）。（2）用0.1%DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在37℃下处理12小时。然后在120℃下高压灭菌30分钟以除去残留的DEPC。RNA实验用的器具建议专门使用，不要用于其它实验。【试剂配制】用于RNA实验的试剂，须使用干热灭菌（180℃，60min）或用上述方法进行DEPC水处理灭菌后的玻璃容器盛装，使用的无菌水须用0.1%的DEPC处理后进行高温高压灭菌。RNA实验用的试剂和无菌水都应专用，避免混用后交叉污染。【制备方法】使用简单的RNA纯化方法即可获得满足于RT-PCR反应的RNA。但为了保证实验的成功率，建议使用GTC法（异硫氰酸胍法）制备的高纯度RNA。●关联产品PrimeScript™RT-PCRKit(CodeNo.RR014A/B)PrimeScript™OneStepRT-PCRKitVer.2(CodeNo.RR055A/B)TaKaRaExTaq®DNAPolymerase(CodeNo.RR001A/B)TaKaRaExTaq®DNAPolymeraseHotStartVersion(CodeNo.RR006A/B)TaKaRaLATaq®DNAPolymerase(CodeNo.RR002A/B)TaKaRaLATaq®DNAPolymeraseHotStartVersion(CodeNo.RR042A/B)PrimeSTAR®DNAPolymeraseHotStartVersion(CodeNo.R010A/B)PrimeSTAR®MaxDNAPolymerase(CodeNo.R045A)PrimeSTAR®GXLDNAPolymerase(CodeNo.R050A/B)PrimeScript™RTreagentKit(PerfectRealTime)(CodeNo.RR037A/B)SYBR®PremixExTaq™(TliRNaseHPlus)(CodeNo.RR420A/B)SYBR®PremixExTaq™II(TliRNaseHPlus)(CodeNo.RR820A/B)PremixExTaq™(ProbeqPCR)(CodeNo.RR390A/B)ProbeqPCRMix(CodeNo.RR391A/B)PrimeSTAR,TaKaRaExTaq,andTaKaRaLATaqareregisteredtrademarksofTAKARABIOINC.SYBRisaregisteredtrademarkofMolecularProbes,Inc.PrimeScript,ThermalCyclerDice,PremixExTaq,andTaKaRaRNAPCRaretrademarksofTAKARABIOINC.本文件由宝生物工程(大连)有限公司翻译制作，最新版本文件请参考TAKARABIOINC.网站。为正确使用Takara产品，您应当掌握本产品的相关知识和使用说明。注意本产品仅供科学研究使用，不能用于人、动物的医疗或诊断程序，不能使用本产品作为食品、化妆品或家庭用品等。未经TAKARABIOINC.书面许可授权或批准，不得制造、许诺销售、销售、进口Takara产品，或者使用Takara产品所有的相关专利及相关商标。如果您需要其他用途的许可授权，请联络我们，或访问我们网站。您使用本产品必须遵守产品网页上适用的全部许可要求。阅读、了解并遵守此类声明的所有限制性条款是您的责任。所有商标均属于各自商标所有者的财产。某些商标并未在全部行政区注册。技术咨询热线：0411-87641685，876416864006518761，4006518769URL: