第六讲-典型生物催化的反应-氧化还原反应

氧化还原反应•氧化还原酶RedoxEnzyme主要包括三种酶：1、脱氢酶（Dehydrogenase）2、加氧酶（Oxygenase）3、氧化酶（Oxidase）1还原反应•脱氢酶广泛用于醛或者酮等羰基和C＝C键的还原反应•根据底物的取代方式，这两个反应都会由具有不对称潜力的潜手性底物生产手性产物•其逆过程（反应）如醇的氧化或者脱氢反应通常会伴随着手性中心的破坏，因而限制了它的应用脱氢酶催化的还原反应OR2DehydrogenaseCofactor-H2CofactorRecyclingSystemR1R2R3XProchiralsubstrateOHR1R1R2R2R1OHorR1R1R2R2R3R3HHHHXXorChiralproducts辅酶的再生•氧化还原酶的催化特点氧化还原酶需要氧化还原辅酶，提供（或接受）还原（或氧化）反应中的化学平衡物质。•辅酶的类型NAD（H）：80％NADP（H）：10％黄素（FMN，FAD）和吡咯喹啉醌（PQQ）比较少•辅酶的特点1、分子相对不稳定2、价格昂贵（化学计量的数量）反应中辅酶仅仅是其氧化还原状态发生变化，因此可以用另外一个氧化还原反应进行原位（insitu）再生。需要加入催化计量的辅酶，降低费用•辅酶重复利用性能的表征TTN（Totalturnovernumber）总转换数：代表循环过程的效率即：在一个完整的反应过程中每mol辅酶可以产生的产物的总mol数。辅酶分子会在循环过程中受到破坏一般TTN需要达到103～104，对于大规模生产，最好能够达到105。•还原反应技术应用的“瓶颈”辅酶的价格（大规模反应）认识问题——深入研究——解决问题当使用完整的微生物细胞作用生物催化剂时，辅酶的再生不再是一个关键问题。微生物含有代谢过程中所需的所有酶和辅酶。通过加入象糖类这些廉价易得的氧化还原平衡物质可以进行辅酶的再生。还原性尼克酰胺辅酶的再生1、非酶的化学还原比如用Na2S2O4TTN≤100，简单，效率较低酶会由于Na2S2O4而引起失活NADHNAD+2、电化学、光化学再生优点：价格低廉，易于使用缺点：反应区域控制性差，副反应多TTN≤10003、酶法还原NADH和NADPH高效，复杂，费用高酶法还原再生•底物偶联法SubtrateSubstrate-H2Auxiliarysubtrate(乙醛等)AuxiliarySubtrate-H2NAD(P)HNAD(P)+SingleEnzyme•方法：辅酶的再生是通过加入一种辅助底物（Donor，供体），在同一种酶的作用下，向相反的方向进行反应。为使反应平衡向所期望的方向进行，供体通常是过量的，TTN≥103•缺点：1、增加了产物纯化难度2、供体的加入可能引起酶的失活3、辅助底物浓度高，引起底物抑制可以考虑使用气膜等进行反应与分离耦合•酶偶联法SubtrateSubstrate-H2Auxiliarysubtrate(乙醛等)AuxiliarySubtrate-H2NAD(P)HNAD(P)+EnzymeAEnzymeB•方法：两个平行的氧化还原反应，分别由两种不同的酶催化主要底物和辅酶再生的转化过程。•特点：两个酶对各自的底物有足够的专一性，使两个酶反应可以各自独立进行。所有的底物和辅助底物不会竞争某一个酶的活性中心，反应效率较高，各自独立进行转化需要加入另外一种酶•NADH有一些进行再生的好方法，已经获得广泛应用，各有优缺点。•NADPH仅在实验室规模进行再生，对于大规模生产尚需开始一种廉价高效的方法FDH法：NADH的再生•酶：FormateDehydrogenaseH-COO-CO2NAD+NADHFDH•优点：1、辅助底物和副产物对酶没有抑制作用2、辅助底物和副产物容易和产物进行分离3、FDH有商品酶供应，容易进行固定化，稳定•缺点：FDH价格昂贵，比活较低（3U/mg）固定化FDH可以解决上述问题•最广泛使用再生NADH的方法•TTN：103～105，但是不能用于NADPH的再生葡萄糖脱氢酶法：NAD(P)H的再生•酶：GDH（Glucosedehydrogenase）OOHOROHHOHOOOHORHOHOOOHORHOHOOHCO2HGDH(R=H)Glucose-6-PDH(R=P)spontaneousNAD(P)+NAD(P)H•特点：从Bacilluscereus中提取的GDH很稳定，比活较高•缺点：1、GDH价格昂贵2、产物分离困难如果不考虑纯化问题，此法在实验室中应用是一个很好的方法，也是再生NADPH的最简单的方法之一•G6PDH也可以用于同样的反应体系•从Leuconostocmesenteroides肠链球菌中提取的酶廉价，稳定，可以NAD(P)＋为底物，而酵母中的G6PDH仅以为NADP＋底物•缺点：G6P价格昂贵•解决方法：用己糖激酶从葡萄糖利用酶法制取，但是又涉及到ATP的再生•可以使用6-硫酸-葡萄糖和从酿酒酵母中提取的G6PDH再生NADPH。硫酸不会作为酸催化剂水解NADPH，且底物比磷酸盐容易制备。•作为Glucose/GDH方法的补充，是再生NADH和NADPH的比较好的方法乙醇脱氢酶和醇脱氢酶法•乙醇脱氢酶（EthanolDH）•醇脱氢酶（AlcoholDH）酵母中：NADHL.mesenteroides：NADPHEtOHAlcoholDHNAD(P)+NAD(P)HCH3-CH=OAldehydeDHNAD+NADHCH3-COO-•广泛用于NADH和NADPH的再生•优点：1、ADH价格适中2、乙醇、乙醛有挥发性•缺点：1、只有醛或者环酮这样有活性羰基的底物产率较高对其他底物必须加入过量（乙）醇或者不断去除（乙）醛方法：通入氮气，扫除乙醛把乙醛转化为乙酸2、TTN较低3、复杂、不稳定的多酶体系4、低浓度的乙醇和乙醛会抑制酶的活力或者引起酶的失活氢化酶（Hydrogenaseenzyme）•直接以分子氢作为供体，再生NADH•优点：1、还原性强2、不损伤酶和辅酶3、没有副产物•缺点：1、对氧化很敏感2、无商品酶3、发酵制备工作复杂氧化型尼克酰胺辅酶的再生•最好也是应用最广泛的再生NAD(P)＋的方法是用谷氨酸脱氢酶(GlutamateDH,GluDH)催化的α-酮戊二酸生成L-谷氨酸的反应•NADH和NADPH都可以作为辅酶•α-酮己二酸可作为底物，产物为L-α-氨基己二酸COO-O-OOC-ketoglutarateNH3H2ONAD(P)HNAD(P)+GluDHCOO--OOCL-glutamateNH3+丙酮酸和乳酸脱氢酶（Lactatedehydrogenase）•再生NAD＋•优点：1、LDH价格便宜2、比活较高，比GluDH高•缺点：氧化还原势能较低,无法再生NADP＋CO2-OPyruvateLDHNADHNAD+OHCO2-L-Lactate乙醛和乙醛脱氢酶•再生NAD＋•TTN在103～104之间•缺点：酶失活优点：1、酵母来源的醛脱氢酶价格便宜2、试剂具有挥发性用酶还原醛和酮•许多酮可以用脱氢酶进行立体选择性还原获得手性仲醇•产物可能为S－醇或者R－醇•Prelog法则：根据底物的空间结构需要而决定的立体化学反应过程可用一个简单的模型进行判断Prelog法则•在Curvulariafalcata细胞进行微生物法还原的立体化学基础上建立•脱氢酶主要是从潜手性酮的Re面释放氢•大多数商品化的脱氢酶以及大多数微生物在进行酮的立体专一性还原的时候都遵循Prelog法则（如YADH，HLADH）•获得到产物为S－醇Prelog法则示意图OSLSLPrelog'sRuleDehydrogenaseNAD(P)HNAD(P)+OHS=small,L=large脱氢酶种类选择性辅酶商品酶Yeast-ADHPrelogNADH是Horseliver-ADHPrelogNADH是Thermoanaerobiumbrockii-ADHPrelog(长链)Anti-(短链酮)NADPH是Hydroxysteroid-DHPrelogNADH是C.falcata-ADHPrelogNADPH否Mucorjavanicus-ADHAnti-PrelogNADPH否Lactobacilluskefir-ADHAnti-PrelogNADPH否PseudomonasADHAnti-PrelogNADH否各种脱氢酶的底物范围ORHOR1R2OOOOORYADHHLADHTBADHHSDH•酵母醇脱氢酶（YADH）底物专一性范围较窄，一般仅以醛和甲基酮为底物，碳链长于一个甲基的酮不能作为底物•其他没有商品酶供应的ADH应用受限制•HLADH是一种常见酶，具有广泛的的底物专一性，较好的立体专一性，因此是生物转化中应用最广的脱氢酶•HLADH由两个几乎相同，各含有两个锌原子的亚基组成的二聚体X衍射对其三维结构研究表明，HLADH的一级结构虽然和YADH相差很大，但是它们的三维结构很相似主要用于对中间单环酮（4－9个C）和双环酮的还原。大于10个C的环酮不易作为底物，无环酮还原时，对映体选择性较低HLADH拆分双、多环酮OHLADHNADH-recyclingrac-twistanone+OOHe.e.68%e.e.90%Xe.e.Ketone(%)e.e.Alcohol(%)O6097S5397XOHH1368HLADHNADH-recyclingXOHH1368+XHHOHrac1S,6S1R,3S,6R•含N杂环酮会使酶失活，和含锌活性中心发生作用•HLADH催化2-烷基噻喃-4-酮的还原反应，转化率可达100％，以非对映体选择性方式进行，得到顺，反-S-醇的混合物。后者经色谱分离后再氧化，可以得到光学纯度很高的酮。HLADH催化的非对映体还原SORHLADHNADH-recyclingSRSRSORSOROHOH+separationoxidationR=Me,Et,i-Pre.e.100%e.e.100%OOHHHLADHNADH-recyclingOOHHHe.e.98%OOHHHLADHNADH-recyclingOOHHHe.e.98%OOHLADHNADH-recyclingOOHe.e.98%潜手性萘烷二酮的选择性还原•YADH和HLADH不能用于开环酮的不对称还原，而TBADH可以还原开环甲基、乙基酮，带杂环取代基的ω-卤代烷基、甲基或三氟乙基酮，得到相应的仲醇，立体选择性很高•α,β-不饱和酮和取代基大于乙基的酮不能作为底物TBADH对映体选择性还原酮OR1RTBADHNADPH-recyclingR1R2R1R2OHOHorRSTBADH遵循Prelog法则，得到的是S-醇对于小分子底物，得到的是R-醇R1R2选择性构型e.e./%CH3C2H5Anti-PrelogR48CH3CH(CH3)2Anti-PrelogR86CH3cyclo-C3H5Anti-PrelogR44CH3n-C3H7PrelogS79CF3PhPrelogR94CH3CCHPrelogS86CH3CH2-CH(CH3)2PrelogS95CH3(CH2)3-ClPrelogS98CH3(CH2)5-ClPrelogS99•TBADH最大的缺陷在于需要NADP(H)作为辅酶•NAD(H)V可以代替NADP(H)•NAD(H)V用NAD(H)和无机钒酸盐(HVO42-)在溶液中合成•由于加入钒酸盐引起的副反应由咪唑缓冲体系来抑制R1R2OR1R2OHNADH+V[NADHV}NAD++V[NAD+V]ADHAuxiliarysubstrate-H2AuxiliarysubstrateV=Vanadate羟基甾体脱氢酶（HSDH）•HSDH适用于还原大型单环和双环酮•天然底物为甾体类化合物，类似的空间结构•产物可以用Prelog法则判断•小分子底物也可以还原，但是选择性就会比较差OR1R2567OHOR1R2OR1R2NAD(P)H-recyclingTBADHorHSDHR