第六章++转基因动物

第六章转基因动物湖南师范大学生命科学学院袁婺洲本章目录6.1动物转基因技术显微注射法逆转录病毒法胚胎干细胞法精子载体法体细胞核移植法6.2提高转基因效率的策略6.3转基因动物的应用转基因动物在生命科学基础研究中的应用转基因技术在动物育种中的应用转基因动物在医药科学研究中的应用6.4转基因动物研究存在的问题及展望转基因动物的概念借助基因工程技术把外源目的基因导入动物的生殖细胞、胚胎干细胞或早期胚胎，使之在受体染色体上稳定整合，并能把外源目的基因传给子代的个体，叫转基因动物（transgenicanimals）1982第一节动物转基因技术1显微注射法2逆转录病毒法3胚胎干细胞法4精子载体法5体细胞核移植法一.显微注射法在显微镜下将体外构建的外源目的基因，用注射针注射到动物受精卵中，使之与动物基因组整合，从而得到转基因动物的方法。1、目的DNA的准备构建目的基因的表达载体：目的基因应包含完整的ORF,顺式调控序列，加尾信号。线性DNA分子的准备DNA浓度：1-3μg/ml.2、小鼠的准备和要求超排受精卵的准备：选择4－6周龄的小鼠，用孕马血清促性腺激素素（PMSG）和人绒毛促性腺激素（hCG）先后进行腹腔注射，做超数排卵处理；注射后10－13小时超排卵，每个母鼠与一个公鼠交配。假孕母鼠的准备：通过注射PMSG和hCG诱导产生，再与结扎的公鼠交配。3、受精卵的分离处死经超排处理的小鼠，从输卵管膨大部位取出受精卵解散卵丘细胞,清洗受精卵在显微镜下确认和选择受精卵。4、显微注射将受精卵置于培养皿或玻片的液滴内，用吸持针吸住受精卵；将外源基因注入受精卵的雄原核内。首只转基因猴安迪和制备它的卵母细胞转基因果蝇的制作5、受精卵的移植将假孕小鼠麻醉，在腹部下方与最后一根肋骨平行的地方开一个小口，在输卵管壶口处用微吸管将注射过的受精卵移入，缝合伤口。按常规饲养，20天前后，后代幼鼠将产出。6、转基因小鼠的鉴定PCRSouthernblotNorthernblotWesternblot标记性状标记性状鉴定转基因果蝇显微注射法的效率每天可注射几百个卵，但大约只有66%能存活；移入子宫后，大约25%的受精卵能发育成幼鼠；其中又有大约25%左右的幼鼠是转基因鼠。理想情况下，30－50/1000一般情况下，1/1000影响转基因动物成功的关键制约因素是什么？提高目的DNA的整合率与表达率顺式调控序列MAR序列同源重组转座子7、显微注射法的不足外源基因整合效率低；随机整合或随机插入，存在插入突变的风险方法复杂，技术性强，设备昂贵等。压力调节仪或程控注射仪（1）逆转录病毒的结构二.逆转录病毒法（2）逆转录病毒的基因组基因组长9kb，LTR细分为5’-u3-R-u5-3’。其中u3区包含病毒的增强子和启动子序列，R区包含一个Cap区。u5区包含聚腺苷酸加尾信号。5’LTR的3’边界区是引物结合位点（PBS）。U5的下游还有ψ序列，包装识别信号。5’LTRLTR3’U3RU5U3RU5ψ小鼠白血病病毒(Mo-MLV)gagpolenv病毒核心逆转录酶外壳蛋白抗原基因基因基因(3)逆转录病毒的生活周期病毒侵入细胞；病毒的RNA基因组在细胞质中反转录成双链的前病毒DNA(复制形式DNA)；前病毒DNA被传送至细胞核，并最终整合到宿主染色体上；整合后的前病毒DNA进而使用宿主细胞的RNA聚合酶转录自己；最后，部分转录的信息被翻译成病毒蛋白质，组装成新的病毒。受体吞噬脱外壳逆转录核蛋白复合体有丝分裂复合体进入核病毒DNA－蛋白复合体中含有由一个病毒DNA的pol基因所编码的内切酶，在此酶的作用下，宿主染色体被切开，而病毒的染色体得以嵌入。此过程发生在细胞有丝分裂的S期。嵌入后的前病毒被细胞的RNA聚合酶II转录为病毒RNA，其蛋白质表达完全依赖于细胞的蛋白质合成机构。(4)逆转录病毒载体的构建为了保证逆转录病毒载体的感染功能，建立包装细胞，在包装细胞里表达三个逆转录病毒的结构基因。所以首先让携带有外源目的基因的逆转录病毒载体感染包装细胞，在包装细胞中被包装成新的子代病毒颗粒，再去感染动物宿主细胞。5’LTRLTR3’U3RU5U3RU5ψ小鼠白血病病毒(Mo-MLV)外源目的基因（5）逆转录病毒介导转基因的优势逆转录病毒载体可同时感染大量胚胎，也可感染稍晚阶段的不同发育时期的胚胎；高效率感染并能在宿主细胞DNA上高度整合，可以大大提高基因的转移效率。但这一高的感染率绝对依赖于细胞的两个特性：一是细胞要具有逆转录病毒的受体，二是目标细胞需要进行细胞分裂。二者缺一不可。（6）逆转录病毒的安全性问题虽然逆转录病毒载体可同时感染大量胚胎，感染效率高，并能在宿主细胞DNA上高度整合，但只可以转移小片断的小于10kb的DNA。而且存在安全隐患。如逆转录病毒在靶细胞染色体上的整合可能造成：1）破坏细胞正常生长的必须基因/抑癌基因2）LTR激活原癌基因3）染色体重排激活原癌基因三.胚胎干细胞法胚胎干细胞（embryonicstemcell,ES细胞）是指从哺乳动物囊胚期内的细胞团中分离出来的尚未分化的胚胎细胞，这种细胞具有发育的潜能性，能够分化出各种组织。（1）利用ES细胞制备转基因小鼠从受精后3.5天的雌鼠子宫中取出胚胎，在胚胎培养基中培养直至囊胚期，脱去透明带。鼠胚贴壁生长4－6天后，ICM增殖为一团圆柱形的细胞，即内细胞团ICM。在体视镜下离散ICM，分别培养在培养板中，筛选ES细胞克隆，特征是细胞小，核大，胞质少，核内有一个或多个凸出的深色核仁结构，细胞紧靠，很难辨认单个细胞。胚胎干细胞介导转基因动物的产生体外直接将外源基因导入ES细胞体外培养筛选再注入到受体囊胚腔中，与其中的囊胚细胞聚集在一起，成为受体胚胎的一部分，参与其分化成为嵌合体再通过杂交成为纯合体（2）利用ES细胞进行基因敲除基因敲除的概念：利用外源的已突变的基因通过同源重组的方法替换掉内源的同源基因,从而使内源基因失活而表现突变体的性状的技术或方法.基因敲除的步骤筛选小鼠目的基因或基因片段构建目的基因靶标载体（带新霉素抗性基因）电穿孔技术将载体转入ES细胞挑选新霉素抗性集落、ES细胞培养分离DNA、PCR或Southernblot保存签定发生同源重组的ES细胞株通过胚囊腔注射将ES细胞转入胚囊中转入假孕鼠子宫中嵌合体×正常鼠杂合体×杂合体(即被敲除一个基因拷贝的老鼠)纯合体表型分析*正负筛选法正选择标记的基因：neor，新霉素抗性基因，能在G418培养基上生长；负选择标记基因：tk，简单庖疹病毒胸腺嘧啶核苷酸激酶基因。使核苷酸类似物GANG或FIAU磷酸化，在DNA复制时整合到DNA链上，导致DNA合成终止，造成细胞死亡。四.精子载体法1989年，Lavitrano等首次利用小鼠附睾精子与外源DNA温育产生转基因小鼠，转基因效率高达30%；外源基因稳定整合到生殖细胞中，由此获得了转基因的株系；哺乳动物精子能够吸附结合外源DNA；但不同的哺乳动物细胞精子吸附DNA的能力不同，活精子比死精子能吸附更多的DNA;经研究发现，外源DNA主要集中在精子的头部，作用部位是精子头部的赤道段和顶体后区。精子吸附外源的DNA方法与精子共育法：用含BSA的PBS对精液进行稀释，与外源DNA溶液混合温育20－40分钟；电穿孔导入法：短时电脉冲引起细胞膜瞬时产生微孔，使外源DNA进入细胞内；脂质体转染法体外受精法：超排处理的卵子与吸附了DNA的精子共温育；胞质内显微注射法：先将精子与外源DNA共孵育，然后将精子头部显微注射到处于减数分裂II期的卵母细胞质中。脂质体转染法五.体细胞核移植法将外源目的基因导入能传代培养的动物体细胞（包括动物成体体细胞、胎体成纤维细胞等），以这些动物体细胞为核供体，通过显微操作或电融合方法使核供体与去核的原核胚细胞或去核的成熟卵母细胞核受体进行细胞重组融合，使其不经过有性繁殖过程。然后再对重组的胚胎进行胚胎移植，进而得到带有外源基因的转基因动物。1997年，英国罗斯林研究所的Wilmut等通过细胞核移植先后克隆绵羊“多莉”和“波莉”成功，其中“波莉”是带有人血友病的凝血因子IX的转基因羊。该技术转基因效率大为提高，转基因后代数目也迅速扩增。在胚胎移植之前，已经筛选阳性细胞作为核供体，核移植之后产生的胚胎100％为转基因个体。多莉绵羊的产生过程第二节提高转基因效率的策略转基因动物效率普遍偏低，表达障碍或表达不可预见性是困扰转基因研究的一个难题。提高转基因效率的策略有：提高定点整合率；建立更完善的转基因方法；选择更好的标记基因；使用大的外源DNA片段；选择强启动子系统促进基因表达等。第三节转基因动物的应用1.采用转基因的过表达系统或基因剔除技术开展基因功能研究，基因调控机制的研究等。2.转基因动物在动物育种中的应用提高抗病能力：如将流感病毒基因或衣壳蛋白基因转入动物体内，增强抗病力。提高动物生长速度：导入生长激素基因，生长激素释放因子基因，类胰岛素生长因子基因等，提高生长速度。如硕鼠。提高动物产毛性能：如将细菌的丝氨酸转移酶基因（SAT）,D－乙酰丝氨硫化氢解酶基因（DAS）导入羊体内，将二硫化物转化为半胱氨酸，提高角蛋白的合成量，改善羊毛性能。改善乳品品质：如导入乳腺特异性表达启动子及大鼠肠乳糖酶基因，降低牛奶中乳糖含量。提高动物生存能力：提高鱼的耐受低溶氧性。WhyTransgenicAnimals3.转基因动物在医药科学研究中的应用异种器官移植：猪器官移植到人身上，要克服受体对外源器官的超急性排斥反应（HAP）的障碍，克服措施有降低或消除补体反应――将人的补体调节蛋白因子基因CD55，CD59等通过转基因方法导入器官供体动物，含有CD55基因猪的心脏移植到猴体内后，猪心脏跳动了10天；通过基因剔除来减少或改变供体器官的表面抗原，降低免疫排斥反应；使供体器官表达人体免疫抑制因子，使得该种猪器官移植后在移植部位持续释放免疫抑制因子，抑制机体对移植物的免疫排斥，形成局部免疫耐受。基因工程：基因治疗与器官移植转基因动物模型作为人类疾病模型、治疗人类疾病的动物模型及新药的筛选模型，如老年痴呆症动物模型的建立：将突变的淀粉样前提蛋白基因通过转基因方法导入小鼠，使其在小鼠脑部过量表达。对转基因鼠的脑皮层和海马部位进行组织切片分析，发现大量的老年斑样结构。模式生物：疾病模型肝癌模型老年痴呆症模型高血压模型I型糖尿病转基因动物模型4.动物生物反应器生物反应器：从转基因动物体液或血液种收获基因产物的方式。乳腺生物反应器和血液生物反应器。优点：生产成本低（1000倍），产量大（一只绵羊每年产奶300－500kg），动物乳腺可对蛋白质进行复杂而专一的翻译后加工，其过程类似于人体，可得到天然活性较高的产品。乳汁纯化蛋白的激素简单，不污染环境。利用哺乳动物工程细胞生产的重组蛋白b干扰素g干扰素凝血因子VIII凝血因子IX促红细胞生成素（EPO）生长因子（hGH）白介素2（IL-2）乙型肝炎表面抗原单克隆抗体CD4受体组织型纤溶酶原激活剂（tPA）迄今为止，已有大约300种重组蛋白药物正在进行临床试验，但在哺乳动物工程细胞中大规模生产的只有少数几种：转基因动物研究存在的问题及展望转基因动物成功率低造成宿主基因突变外源基因表达水平不高逆转录病毒可能从整合位点脱落，恢复病毒特性基因污染等安全性问题等。