HPLC测定小金胶囊中乌头碱的含量

HPLC测定小金胶囊中乌头碱的含量成都中医药大学学报JournalofChengduUniversityofTCM2021年6月第32卷第2期Jun12021,Vol132,No12HPLC测定小金胶囊中乌头碱的含量侯亚会1陈永孝2(11四川滇虹医药开发有限公司,四川成都610041;21四川省天基生物药业有限公司,四川成都611137)摘要:目的:建立小金胶囊中乌头碱的HPLC含量测定方法。方法:采用ZorbaxExtend—C18色谱柱(416mm×250mm,5μm),流动相为甲醇-01005%磷酸水溶液(内含0104%三乙胺)(68:32),流速:110mL/min,柱温:30℃,检测波长235nm。结果:乌头碱的浓度在61175～19716μg/mL范围内线性关系良好(R2=019999),平均回收率97135%,日内和日间精密度RSD分别为0177%和1155%。结论:所建方法准确、可靠,可用于该药品的质量控制。关键词:小金胶囊;乌头碱;高效液相色谱法中图分类号:R28411文献标识码:A文章编号:100420668(2021)022*******作者简介:侯亚会,女,1980年生,助理工程师,研究方向:新药开发;陈永孝,通讯作者,男,1973年生,助理工程师,研究方向:药品质量标准研究。HPLCassayingofaconitineinXiaojincapsulesHouYa2hui1,ChenYong2xiao2(11SichuanDihonMedicalDevelopmentCo1,Ltd1,Chengdu610041,China;21SichuanTianjiBio-pharmCo1,Ltd1,Chengdu611137,China)AbstractObjective:ToestablishaHPLCmethodfortheassayingofaconitineinXiaojincapsules1Methods:Zor2baxExtend—C18(416mm×250mm,5μm)columnwasused1Withamobilephaseofmethanol-01005%phosphoricacidsolutionandcontainin0104%triethy-lamine(68:32)1Theflowratewas110mL?min-1andthecolumntemperaturewas30℃1Thedetectionwavelengthwas235nm1Results:Thelinearityofaconitinewasgoodwithinrangeof61175～19716μg?mL-1(R2=019999)1Theaveragerecoverywas97135%1Theforinter-dayandintra-dayRSDwas0177%and1155%respectively1Conclusion:ThemethodisaccuratereliableandsuitableforthedeterminationofaconitineinXiaojincapsules1Keywords:Xiaojincapsules;aconitine;HPLC小金胶囊由麝香、木鳖子(去壳去油)、制草乌、枫香脂、制乳香、制没药、五灵脂(醋炒)、当归(酒炒)、地龙及香墨组成,具有散结消肿、化瘀止痛的功效[1]。其中草乌中乌头碱的毒性很强,人口服012mg即可出现恶心、呕吐、头晕、眼花、脉缓、呼吸困难、神志不清、心律紊乱等中毒现象[2],为了保证临床用药安全有效,建立了HPLC法测定小金胶囊中乌头碱含量。1仪器、试药及样品仪器:Alltech426高效液相色谱仪,UVIS-201紫外检测器,ChromStation数据处理系统;BP211D电子天平。试药:甲醇为色谱纯,其余试剂均为分析纯。对照品:乌头碱(含量测定用,批号:110740-202110)由中国生物制品检定所提供。样品:小金胶囊(批号:080802)由天基生物制药有限责任公司生产。2实验条件采用ZorbaxExtend—C18(416mm×250mm5μm)色谱柱;以甲醇-01005%磷酸水溶液(内含0104%三乙胺)(68:32)为流动相,流速:110mL/min,检测器采用紫外检测器,检测波长为235?09?第2期侯亚会等HPLC测定小金胶囊中乌头碱的含量nm[3];结果乌头碱保留时间合适,完全分离,测得乌头碱对照品、样品、阴性对照色谱图见图1。A乌头碱对照B小金胶囊样品C阴性图1乌头碱对照,样品,阴性对照色谱图3方法与结果311溶液的制备对照品溶液的制备:精密称取乌头碱对照品适量,用甲醇溶解,并稀释制成50μg/mL的对照品溶液。供试品溶液的制备:取小金胶囊内容物5g,精密称定,置锥形瓶中,加氨试液拌匀湿润,放置2h,加无水乙醚60mL,超声处理30min,放置12h,过滤,滤渣用无水乙醚洗涤3次,每次20mL,合并乙醚液,加盐酸溶液(4→100)振摇提取3次,每次20mL,合并盐酸溶液,盐酸液加浓氨试液调pH值至9～10,加无水乙醚振摇提取3次,每次20mL,合并乙醚液,低温挥干,残渣用甲醇溶解,并定量转移至5mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0145μm)滤过,作为供试液。312标准曲线的制备精密称取乌头碱对照品适量,加甲醇制成每1mL含011976mg乌头碱对照品溶液。精密吸取该溶液5mL于10mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度;按以上操作,依次配制成6个梯度对照品溶液,在上述色谱条件下,分别精密吸取上述对照品溶液各10μL,注入高效液相色谱仪,测定乌头碱峰面积。以对照品浓度为横坐标,峰面积为纵坐标绘制标准曲线,乌头碱的浓度在61175～19716μg/mL范围内线性关系良好,回归方程为:Y=806514X+363012,R2=019999。313精密度试验31311重复性试验取同一批样品,照供试品溶液制备方法制备供试液,精密吸取供试品溶液10μL注入色谱仪,重复进样6次,测定乌头碱峰面积,重复性试验结果RSD=0160%,说明重复性较好。31312中间精密度同一批样品共6份,各精密称定,根据不同日期、不同操作人员进行试验,照供试品溶液制备方法制备供试液,分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10μL注入色谱仪,分别计算含量。结果日内精密度RSD=0177%,日间精密度RSD=1155%,表明日内、日间精密度较好。314供试品溶液的稳定性取同一供试品溶液,分别于0、2、4、6、8h各进样1次,测定乌头碱峰面积,结果RSD=1199%,表明供试品溶液在8h内基本稳定。315准确度试验精密称取已知含量同一批号(批号:080802,含量为8150μg/g)的小金胶囊内容物约5g,精密称定,共9份,分别置锥形瓶中,再分别精密加入乌头碱对照品溶液(4718μg/mL)一定量(加入量见下表),按供试品溶液的制备方法制备,按上述色谱条件测定乌头碱的含量,并计算回收率,结果见表1。表1准确度试验(乌头碱)样品量g样品含量μg加入量μg测得总量μg回收率%平均回收率%RSD419402411993812479102961845121824413538124821509917641952142109381247911496189419859421384718088149961465118944411147180911619913741953242110471808810096103510821431205713699188981814198394213657136971719615041985642138571369711495147971351159结果分析:准确度试验表明,该含量测定方法回收率较好。316样品测定分别精密称取不同批号的小金胶囊内容物5g,按供试品溶液制备的方法制备,按上述的含量测定方法测定,结果见下表。(下转第96页)?19?成都中医药大学学报2021年第32卷阙,天枢,中脘,关元,水分等。⑵重视俞募配穴:古代文献中使用频次最高的为大肠俞和天枢,此外中脘和胃俞,章门和脾俞,小肠俞和关元也是常用俞募穴。⑶常循经取穴:症状以腹泻为主则多取与水湿相关的经络和穴位:①多取任脉穴位,共使用111频次,占总穴次的2619%;常用穴位为神阙、中脘等;②多取足太阳膀胱经经穴,共使用110频次,占总穴次的2616%;常用穴位为大肠俞、三焦俞、脾俞、肾俞等;③多取足太阴脾经穴位,共使用76频次,占总穴次的1814%;常用穴位为阴陵泉、三阴交、太白、公孙等;④多取利水除湿的穴位:如水分。以腹痛腹胀为主症时,则多取与脾胃相关的经络和穴位:足阳明胃经和足太阴脾经的穴位共使用了79频次,仅次于任脉的取穴。(4)多按照病因进行脏腑八纲辩证:《灸法秘传》载:“泄泻有五,乃脾虚、肾虚、寒湿、湿热、食积也。……在医家当分而治”。古籍中在治疗便秘时也依此原则,如《针灸逢源》记载:“脾虚,不大便:三阴交,灸二十壮”。312古代处方刺灸法特点古代在治疗肠易激综合征时针、灸并用。灸法多用于虚证和脱证,如《扁鹊心书》曰:“脾肾气损……灸命门、关元……”;《类经园翼》曰:“百会,久泻滑下陷脱者,灸三壮…11”;《针灸逢源?证治参详?肿胀门》载:“脾虚,不大便:三阴交,灸三十壮”。此外《神灸经论?二阴证治》还用“巴豆为饼填入脐中,灸三五壮”治疗“大便秘结,腹中积痛”的实寒证。313总结针灸的选穴和刺灸方法的选择是决定针灸临床疗效的关键因素之一。发表于2021年的CochraneSR[4]认为目前尚无确切证据表明针灸对于肠易激综合征的有效性,究其原因,除现有研究存在方法学缺陷及样本量较小外,穴位和刺灸方法的选取也是影响疗效评价结果的因素。在该系统评价纳入的6篇文章中,均采用固定处方,穴位数量1至9不等;除1篇为耳穴外,经穴多采用针刺或者电针。古代治疗肠易激综合征多以症状为切入点,在八纲、脏腑辨证的基础上,循经取穴,并重视特定穴的配伍,采用针、灸并用的治疗手段。现代针灸临床应该在经现代实验、临床研究证实的固定处方基础上,完善、规范证侯的分型,并借鉴古籍中丰富、有效的辨证取穴方案,配穴加减。此外,在针、灸并用的基础上,应根据患者病情,灵活采用现代多样的治疗手段(电针、穴位注射、埋线等),以提高患者依从性和临床疗效。参考文献[1]英国胃肠病临床服务协会1成人肠易激综合征诊治新指南[J]1现代消化及介入诊疗,2021,12(2):1411[2]王永炎1中医内科学[M]1上海:上海科学技术出版社,2021:1791[3]罗永芬,梁繁荣1中华大典?医药卫生典?医学分典?针灸推拿总部[M]1成都:巴蜀出版社,20211[4]LimB,ManheimerE,LaoL,etal1Acupuncturefortreatmentofirritablebowelsyndrome[J]1CochraneDa2tabaseofSystematicReviews12021,Issue11Art1DOI:1011002/146518581CD0051111(收稿日期:2021202217)(上接第91页)附表10批样品含量测定结果批号乌头碱含量(μg/g)平均含量(μg/g)080101511208040161270807018120080702813508070381450808018152080802815008100171450810027160081101713671614讨论411乌头碱属双酯型C219二萜类生物碱,具有强烈的毒性。测定其含量,有利于临床用药安全。412乌头类生物碱在二氯甲烷中比较稳定,但在紫外检测时会影响目标成分的响应;在甲醇中很不稳定,但不影响乌头类生物碱的紫外吸收。故本次实验选用甲醇为溶剂,将对照品溶液存放在0℃冰箱中,可稳定保存1周。413由于本品成分复杂,经试验,0104%三乙胺可以满足乌头碱与杂质峰的分离,且得到较好的峰形,并在流动相中加入少量酸,可使分离达到目的,