Western Blot实验方法

WesternBlot实验方法一、溶液配制1.100mMNaF(NaFMW=41.99)10ml称取NaF41.99mg，超纯水8ml溶解后定容至10ml2.30%聚丙烯酰胺凝胶液（交联度3%）：100ml丙烯酰胺29gN,N'-甲叉双丙烯酰胺1g加去离子水至100ml混匀,棕色瓶中避光保存3.0.01mol/L乙酸钠NaOAc（pH5.2）（MW=136.08）25ml136.08×0.01×25×10-3=34mg，称取34mg乙酸钠，加入20ml蒸馏水，待其溶解后，乙酸调pH值至5.2，再定容至25ml。4.1MDTT10mlDTT(二硫苏糖醇)1.545g0.01mol/L乙酸钠（pH5.2）8ml溶解后定容至10ml，0.22μm滤膜抽滤。5.4×SDS-PAGELoadingBuffer10ml0.2MTris-HCl(pH=6.8)1M4ml8%SDS10%0.8g0.4%溴酚蓝40mg40%Glycerol4ml三蒸水定容至10ml0.4MDTT临用前1M贮存液按400μl/ml比例加入上述溶液中。6.1.5MTris(pH8.8)100mlTris18.171g加入三蒸水80ml，溶解后加入浓HCl调pH值至8.8，定容至100ml7.1MTris(pH6.8)100mlTris12.114g加入三蒸水80ml，溶解后加入浓HCl调pH值至6.8，定容至100ml8.1×电泳缓冲液：1000ml0.25MTris3g0.19MGlycine14.4g0.1%SDS1g三蒸水定容至1000ml9.1×TransferBuffer：1000ml0.25MTris3g0.19MGlycine14.4g三蒸水定容至900ml使用前加入甲醇100ml10.PBSBuffer137mMNaCl8g2.7mMKCl0.2g10mMNa2HPO41.44g2mMKH2PO40.24g三蒸水定容至1000ml调节pH值至7.4，高压灭菌，4℃保存11.PBSTBuffer500mlPBS中加入250μlTween-20。12.RIPA细胞裂解缓冲液(100ml)终浓度Tris0.6g5.0mM(pH7.4)NaCl0.87g150mMEDTA37.22mg1mMNP-401ml1%SDS0.1g0.1%脱氧胆酸钠0.5g0.5%溶解于80ml超纯水中，待溶解后加入HCl调pH值至7.4，定容至100ml。常规裂解细胞时，于使用前加入储存浓度终浓度PMSF100mM10μl/1ml1mMNaF100mM10μl/1ml1mMAprotinin10μg/μl0.2μl/1ml2μg/μlLeupetin10μg/μl0.2μl/1ml2μg/μl二、WesternBlot1.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）(1)制备浓缩胶和分离胶：根据蛋白大小选择合适的分离胶浓度(2)灌胶：按照仪器使用说明安装好垂直板SDS－聚丙烯酰胺凝胶制胶装置，迅速在两层玻璃板间灌入分离胶（距顶端约1.5cm）,并在胶面上用少量蒸馏水覆盖；待分离胶聚合完全后,用滤纸吸去凝胶表面的蒸馏水，再灌入浓缩胶,插入干净的梳齿,待浓缩胶聚合完全后，安装好电泳槽，将1×SDS-PAGE缓冲液倒入电泳槽，拔出梳齿，用电泳缓冲液冲洗加样孔。(3)上样：以5μl中分子量蛋白标志物作为参照，取蛋白液20μg~30μg上样（后期实验发现使用放射自显影方法时，上样量20μg即可）。(4)电泳：恒压方式，80V，待样品进入分离胶后，电压调至110V。当示踪剂到达分离胶底部时结束电泳，约2~2.5h2.WesternBlot(1)转膜取2张海绵及两张与Whatman3M滤纸及一张硝酸纤维素膜（NC膜）浸泡于适量WesternBlotting转移缓冲液中3至5min。将海绵、滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜及另外滤纸、海绵放置好，注意使各层之间不留有气泡。接通电源，350mA湿转100min~2h（根据蛋白大小选择，一般100min足够），如为一张膜则选择150mA2h。（层次如下图）(2)封闭NC膜取出，PBST清洗，5min/次，共3次，将NC膜浸入适量的封闭液（5%脱脂奶粉，溶于PBST，约50ml）中，室温震荡1-2小时后4℃放置过夜。(3)抗原抗体反应以PBST清洗NC膜3次，5min/次，剪下目的蛋白所在区域，将其置入一杂交袋中，加入稀释的一抗2~3ml（用封闭液稀释一抗），将杂交袋封闭，37℃2~3小时。剪开杂交袋，以PBST清洗NC膜4次，5分钟/次。加入稀释二抗6ml~10ml，根据膜多少调整，（用封闭液稀释二抗），室温振荡2小时。(4)放射自显影取出NC膜，以PBST清洗4次，5~15分钟/次（根据显影后背景调整洗膜时间，背景深则延长清洗时间），再用PBS清洗1次，NC膜放在一张干净滤纸上，干燥后，将其平铺于保鲜膜上，蛋白面向上，将放射自显影工作液（按试剂盒操作说明配置成工作液）滴于膜上，1~2min后，将显影液控干，封于保鲜膜，放入X片盒中。暗室中，放入胶片，曝光1~5min，显影液中显影30sec，定影。三实验中问题1.曝光出来后,背景都是黑的,而目的条带是透明原因：信号太强，瞬间淬灭了，在背景的衬托下，目的条带的位置反白。可以降低上样量或调整一抗和二抗的用量及孵育时间。2.显影后背景很深，条带不清晰。解决方法：上样量不变的情况下，可适当增加一抗的稀释度（例如将一抗从1:1000调整至1:1200），并封闭一抗4℃过夜。次日室温摇约30min-1h，洗膜，二抗正常应用，室温1h-2h（1h30min效果可），洗膜15min×4次，显影结果可改善，背景变浅，条带清晰。