分子生物学

分子生物学1、分子生物学研究：核酸、蛋白质等所有生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学。2、1953年，Watson和Crick提出脱氧核糖核苷酸的双螺旋膜型。3、巴巴拉·麦克林托克发现转座。4、2021年，Fire和Mello发现RNA干扰，获得诺贝尔生理医学奖。第二章染色体与DNA1、染色体包括：DNA和蛋白质两大部分。2、染色体中DNA的包装过程：（核小体→螺线管→超螺线管→染色体）①核小体的形成是染色体中DNA压缩的第一阶段。核小体的组成：组蛋白+200bpDNA。核小体组蛋白：H2A、H2B、H3、H4各两分子生成的八聚体，并伴有H1在核小体在外边，直径10nm。②将200bp的DNA分子（2nm）缠绕在核小体外，从68nm压缩到10nm中，压缩率1/7③六个核小体形成一个螺线管，压缩率1/6，直径30nm④螺线管形成超螺线管，压缩率1/40，直径4000nm⑤超螺线管形成染色单体，压缩率1/53、DNA的结构：（1）DNA的一级结构：指4种核苷酸的连接及排列顺序。（2）DNA的二级结构：指两条多核苷酸链反相平行盘绕所成的双螺旋结构。（3）DNA的高级结构：指DNA双螺旋进一步扭曲盘转所形成的特定空间结构。（1）B-DNA构象特点：①A-T丰富的DNA片段常呈B-DNA构型；②脱氧核苷酸在外侧，碱基在内侧；③链间形成的有螺旋状凹槽构成：大沟、小沟（沟用来接收Pr的结合）；④相邻碱基对平面间距0.34nm，结构重复周期3.4nm，双螺旋直径2.0nm；⑤磷酸二脂键链接核苷酸；6）脱氧核糖环平面基本与纵轴大致平行（2）A-DNA构象：DNA模板链与转录所得RNA链间形成的双链，双链RNA之间形成的构象也是A-DNA构象。（3）Z-DNA构象特点：①12个碱基一圈，比A构型紧；②只有一个螺旋沟，难于蛋白质结合；③重复的结构式二核苷酸；④碱基不再.，外圈的碱基难被化学物质结合识别5、DNA的复制：(1)方向：5’→3’(2)原料：①拓扑异构酶；②解旋酶；③单链结合蛋白（SSB）；④引物合成酶；⑤DNA聚合酶；⑥连接酶(3)特点：DNA半保留复制和DNA半不连续复制：(4)方式：DNA半保留复制、DNA半不连续复制、双向复制6、DNA修复：（1）错配修复：保存母链，修正子链。识别新合成链中的错配并校正DNA子链。（2）切除修复：①碱基切除修复；②核苷酸切除修复7、DNA的转座：或称移位，是由可移位因子介导的遗传物质重排现象。8、转座子：存在于染色体DNA上的可自主复制和移位的基本单位。分类：插入序列（IS）、复合型转座子9、玉米中的控制因子：Ac-Ds系统，即激活-解离系统：Ac能够自主转座，形成不稳定基因突变，使Ds因子活化、转座。Ds属于非自主因子，解离因子，当Ac存在时导致附近结构基因失活和表达水平的变化。10、转座作用的机制：转座可被分为复制型和非复制型两类。第三章生物信息的传递（上）——从DNA到RNA1、基因表达：包括转录和翻译个阶段。2、转录：拷贝出一条与DNA链序列完全相同（除了T→U之外）的RNA单链的过程，是基因表达的核心步骤3、翻译：以新生的mRNA为模板，把核苷酸三联遗传密码翻译成氨基酸、合成多肽链的过程，是基因表达的最终目的。4、启动子：是指确保转录精确而有效地起始的DNA序列，是基因表达调控的上游顺式作用元件之一。5、转录单元：是一段从启动子开始至终止子结束的DNA序列，RNA聚合酶从转录起点开始沿模板前进，直到终止子为止，转录出一条RNA连。6、增强子，或强化子：一种能强化转录起始的序列。7、原核生物的启动子包括-10区-与35区，-10区与-35区的最佳距离大约是16-19bp。8、真核生物mRNA特点：(1)mRNA的5`端存在“帽子”结构（甲基化鸟嘌呤）；(2)绝大多数真核生物mRNA具有多聚A尾巴9、真核生物mRNA作用：(1)“帽子”结构作用：①有助于翻译的开始：与核糖体小亚基相结合；②保护mRNA不被降解，半衰期长；③成熟产物运输过程中的必需物质；④促进转录(2)多聚腺苷酸尾巴作用：①穿过核膜所必须的部分；②提高mRNA的稳定性；③与翻译有关10、原核生物转录终止的类型：不依赖于ρ因子的终止和依赖于ρ因子的终止类型11、RNA的编辑：是某些RNA，特别是mRNA前体的一种加工方式，如插入、删除或取代一些核苷酸残基，导致DNA所编码的遗传信息的改变，因为经过编辑的mRNA序列发生了不同于模板DNA的变化。12、核酶：一类具有催化功能的靶位点RNA分子，通过催化RNA链中磷酸二酯键的断裂，特异性剪切底物RNA分子，从而断裂基因的表达。分类：根据不同的核酸具有的催化功能分为：剪切型核酶、剪接型核酶。第四章生物信息的传递（下）——从mRNA到蛋白质1、遗传密码的性质：（1）密码的连续性；（2）密码的简并性；（3）密码的通用性与特殊性；（4）密码子和反密码子相互作用2、tRNA的二级结构：三叶草型；tRNA的三级结构：L型3、tRNA的种类：①起始tRNA和延伸tRNA；②同工tRNA；③校正tRNA4、无义突变：一个核苷酸的改变可能使代表某个氨基酸的密码子变成终止密码子（UAG、UGA、UAA），使蛋白质合成提前终止，合成无功能的多肽或无意义的多肽。5、错义突变：结构基因中某个核苷酸变化，使得一种氨基酸的密码变成另一种氨基酸的密码。6、氨酰-tRNA合成酶：是一类催化氨基酸与tRNA结合的特异性酶。AA-tRNA合成酶既要识别tRNA，又要能识别氨基酸它对两者都具有高度的专一性。7、真核生物核糖体结构：真核生物核糖体体积较大，降解系数为80s，相对分子质量为3.9~4.5x103KDa。由60s和40s两个亚基组成，RNA占3/5，蛋白质占2/5，,60s亚基（5sRNA、28sRNA、5~8sRNA），40s亚基8、原核生物核糖体结构：原核生物核糖体较小，沉降系数为70s，相当分子质量为2.5x103KDa，由50s和30s两个亚基组成，rRNA约占2/3，蛋白质约占1/3,50s亚基（5sRNA、23sRNA），30s亚基（16srRNA）9、蛋白质的生物合成步骤：（1）氨基酸活化（2）肽链的起始、伸长、终止（3）新合成多肽链的折叠和加工。10、在真核生物中，起始氨基酸是甲硫氨酸；在原核生物中，起始氨基酸是甲酰甲硫氨酸。11、原核生物翻译的起始：（1)30SrRNA和50SrRNA相分离（2)30S小亚基先与mRNA模板相结合（需要识别SD序列）（3)30S小亚基再与fMet-tRNAMet（甲酰甲硫氨酸-氨酰tRNA）结合（4)30S小亚基与50S大亚基结合12、真核生物翻译的起始：（1)40SrRNA与60SrRNA相分离（2)40S小亚基首先与fMet-tRNAMet结合（3）40S小亚基mRNA模板相结合（无需识别SD序列）（4）40S小亚基与60S大亚基结合成80S·mRNA·Met-tRNAMet起始复合物13、蛋白质前体的加工：（1）N端fMet或Met的切除；（2）二硫键的形成；（3）特定氨基酸的修饰；（4）切除新生肽链中的非功能片段。14、蛋白质转运分类：（1）翻译-转运同步机制运输：依赖信号肽；（2）翻译后运转机制运输：依赖传导肽第五章分子生物学研究法（上）——DNA、RNA及蛋白质操作技术1、重组DNA技术：又称基因工程，将不同的DNA片段（如某个基因或基因的一部分），按照预先的设计定向连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状的技术。2、限制性内切核酸酶：是一类能够识别DNA分子中的某种特定核苷酸的序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。3、基因工程技术路线：（1）获得目的基因和载体。（2）切割、连接新的重组DNA分子。（3）重组DNA分子导入受体细胞，并在细胞中复制遗传。（4）对转化子筛选和鉴定。（5）对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。4、核酸凝胶电泳有2种：琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳在凝胶电泳中，加入适量溴乙啶（EB）染料对核酸分子进行染色。5、细菌转化：一种细菌菌株由于捕获来自供体菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的过程。6、感受态细胞：处于易于接受外源DNA的细胞状态的细胞。7、细菌转化的方法：电击法、CaCl2法8、CaCl2法原理：将快速生长的大肠杆菌置于低温(0℃)预处理的低渗CaCl2溶液，使细胞膨胀，细胞膜通透性发生变化，极易于外源DNA相黏附并在细胞表面形成复合物。此时在将该体系转移至42℃下做暂时的热刺激，外源DNA就可能被细胞吸收。进入细胞的外源DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在选择性培养基上培养，筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆。9、PCR（聚合酶链式反应技术）：是一种体外快速扩增特定基因或DNA序列的技术。（1）原理：是DNA体外合成放大反应，根据细胞分裂中DNA的半保留复制机理。其基本反应步骤为：①模板DNA的解链（变性）②引物与模板DNA相结合(退火)③DNA合成（延伸）④循环（2）反应体系：模板DNA、PCR引物、dNTP、DNA聚合酶（3）反应参数：①高温变性：94℃或95℃②低温退火：50℃③适温延续：72℃，10、实时定量PCR：利用带荧光检测的PCR仪对整个PCR过程中扩增DNA的累积速率绘制动态变化图，从而消除了在测定终端产物丰度时有较大变异系数的问题。11、荧光染料SYBRGreenI：激发波长520nm，只能与DNA双链结合，并且只有在与DNA结合时才能被激发出荧光。缺点：只能识别DNA双链而不能区分不同的DNA双链分子。12、TaqMan探针：是一小段被设计成可以与靶DNA序列中间部位结合的单链DNA（一般为50~150bp），并且该单链DNA的5’和3’端带有短波长和长波长两个不同荧光基团。13、Ct值：产物荧光强度首次超过设定阈值时，PCR反应所需的循环数。其大小与原始模板成反比。14、基因组DNA文库：把某种生物的基因组全部DNA序列切成适当大小，分别与运载体组合，导入微生物细胞，形成克隆，这样的克隆片段的总汇成为基因组DNA文库。15、总RNA的提取：实验室常用的方法是异硫氰酸胍-苯酚抽提法。试剂：Trizol试剂，由苯酚和异硫氰酸胍组成。作用：破坏细胞结构，使存在于细胞质及核内的RNA释放出来，并使核糖体蛋白与RNA分离，还能保证RNA的完整。16、RNA浓度测定：通过OD260和OD280来判断。OD260为1时相当于浓度为40μg/mL，而OD260/OD280值在1.8～2.0显示DNA纯度较好，如有蛋白质或酚污染则明显低于1.8。17、cDNA合成中，常用的引物是oligodT18、SNP（单核苷酸多态性）：指基因组DNA序列中由于单个核苷酸（A、T、C和G）的突变而引起的多态性。19、根据SNP在基因组中的分布位置可分为：基因编码区SMP（cSNP）、基因调控区SNP（pSNP）和基因间随机非编码区SNP（rSNP）等三类。20、cSNP（基因编码区SNP）分为：同义cSNP、非同义cSNP21、SNP检测技术：基因芯片技术、Taqman技术、（分子信标技术、焦磷酸测序法）。22、蛋白质组学：指在蛋白质水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平、翻译与修饰、蛋白与蛋白相互作用等，并由此获得关于疾病发生、发展及细胞代谢等过程的整体认识。23、双向电泳技术原理：该方法依赖于蛋白质的两个重要特性，等电点和相对分子量来分离蛋白质。蛋白质是两性分子，在不同的pH的缓冲液中表现出不同的带电性，在电流作用下，在以两性电解质为介质的电泳体系中，不同等电点的蛋白质会聚集在介质上不同的区域（等电点）而被分离；蛋白质的相对分子质量决定了SDS-蛋白复合物在凝胶电泳中的迁移率。聚丙烯酰胺凝胶中的去垢剂SDS带有大量的负电荷，与之相比，蛋白质所带电荷量可以忽略不计。因此，蛋白质在SDS凝胶电场中的运动速度和距离完全取决于