实时荧光定量PCR标准品的制备及应用

实时荧光定量PCR标准品的制备及应用?临床研究?实时荧光定量PCR标准品的制备及应用罗勇军,刘昕(第三军医大学分子遗传教研室,重庆400038)摘要:目的探讨并建立快速而准确用于实时荧光定量PCR标准品的方法。方法通过培养细胞,提取总RNA并逆转录为cDNA后做PCR,电泳,胶回收,T2A克隆,测序后,大量提取质粒,送公司定量。结果获得了预期希望的质粒。结论该方法能大量制备质粒标准品,在实验中取得较满意的效果。关键词:实时荧光定量PCR;标准品;Taqman探针中图分类号:R446.61文献标识码:A文章编号:167128348(2021)0320414202Themethodofpreparationforthestandardplasmidsofreal2timePCRanditsapplicationintheexperimentsLUOYong2jun,LIUXin(DeparmentofMolegenetics,theThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038,China)Abstract:ObjectiveToexplorethemethodofpreparationforthestandardplasmidsofreal2timePCR.MethodsCellculture,RT2PCR,agarosegelelectrophoresis,gelextraction,T2Aclone,sequance,plasmidsminiprep,quantifyintheBioasiacompany.Re2sultsWegetthestandardplasmids.ConclusionThisisagoodwaytogetthestandardKeywords:real2timePCR;standardplasmids;Taqmanprobe近几年来,实时荧光定量PCR技术因高精确度、高灵敏性、污染少等优点已在临床医学及生物医学基础科研中得到广泛应用。它是在每个循环后都对扩增产物进行检测,其灵敏度比传统PCR高出2～3个数量级,且能通过CT值较好的反映目的DNA初始模板量。随着实时荧光定量PCR的逐步大量应用,我们也需要能更加精确反映目的DNA的标准品。1材料与方法1.1实验材料与仪器A549细胞(由本室保存),1640培养基(Gibico公司),小牛血清(兰州民海生物),Tripure(Roch公司),逆转录试剂(Promega公司),PCR试剂(宝生物公司),胶回收试剂盒(Omega公司),大量质粒抽提试剂盒(Omega公司),pMD182Tvector连接试剂盒(宝生物公司),感受态菌JM109(本室保存),氨苄青霉素50mg/ml,LB培养基,按《分子克隆》配,TAQMAN探针由上海基康公司合成,X2gel,IPTG(Sigma公司),定量PCR仪为MJrearsh公司的option2,普通PCR仪为MJrearsh公司的PTC2100,nanodrop紫外分光光度仪。1.2实验方法1.2.1RNA提取用1640培养细胞(饱和湿度,孵箱温度为37℃,CO2浓度为5%,10%小牛血清),当细胞融合率到80%时用Tripure提取总RNA,用紫外分光光度仪检测RNA的量及用1%甲醛变性胶电泳检测RNA的质量,结果如图1。1.2.2RT2PCR逆转录为cDNA后扩增ESP1(274BP),引物为(由基康公司合成)senseprimer:5′TGCTAC2CACGACTTTACGC3′antisenseprimer:5′AACGATCTTC2CTGGAGTTTAT3′反应体系为:总体积为50μl,其中含0.1mmol/LdNTP,1.75mmol/LMgCl2,0.4μmol/LFP,0.4μmol/LRP,0.1μ/μltaq酶,模板2μl,1×反应缓冲液,程序为94℃4min,94℃30s,54℃45s,72℃1min,25循环,在MJre2search公司的PTC2100普通PCR仪上扩增,结果见图2。1.2.3T2A克隆1.2.3.1连接按说明书进行胶回收,然后使用pMD182Tvector连接试剂盒进行连接,体系为:ligationsolutionI5μl,pMD182Tvector0.5μl,48.3ng/μlDNA2μl,H2O:2μl,16℃过夜。1.2.3.2转化取5μl连接液放入200μl感受态细菌中(1.5ml离心管),冰上放置30min,42℃静止水浴50s,加1ml/LB,颠倒20次,将管子放入37℃摇床(250RPM)复苏50min,取80μl菌液放入一小管,各加40μlX2gel,4μlIPTG,混匀,涂板(直径7cm),37℃培养18h。1.2.3.3酶切鉴定挑取白色菌落进行小量培养,提取质粒,用NEB的EcRo1与HindIII进行酶切,体系为:buffer22μl,EcoRI1μl,HindⅢ1μl,质粒2μl,H2O4μl,37℃酶切3h,酶切后经1.5%琼脂糖电泳鉴定见图3,并将鉴定为初步正确的质粒的菌落划氨苄平板,挑取单菌落增菌,将菌液送上海基康公司测序。1.2.4质粒定量证实为ESP1的片段后,大量制备质粒,并保存质粒、菌落。在提取质粒后吸50μl送上海博亚公司定量。实验过程如下,首先测OD260,取10μl质粒稀释到500μl,OD值为0.040,然后算出质粒的质量(OD值×2.5×10-6),再算出摩尔浓度(质量除以碱基数÷324.5÷10),再乘以阿拂加的罗常数(6.02×1023),结果为3.09×1010拷贝/μl。1.2.5质粒的倍比稀释将质粒进行倍比稀释,及取10μl质粒加入90μl双蒸水,混匀,依次类推,共稀释6个梯度,直到3.09×104拷贝/μl。由于避免移液器的误差,作者认为取10μl质粒进行稀释比较合适,稀释后分装成小管,避免质粒反复冻融导致降解。当然也有人提出用tRNA溶液溶解质粒,避免降解,作者认为用双蒸水稀释质粒也能达到较好的效果[1]。1.2.6标准品的鉴定标准品的探针与引物由基康公司合成probeFAM5′AACTGCTCTGCTCTGG3′,senseprimer5′CCACGACTTTACGCAGCAGAC3′antisenseprimer5′AGGGCTTCCCGGATAGCA3′反应体系为:总体积为25μl,其中含0.1mmol/LdNTP,3.5mmol/LMgCl2,0.2μmol/LFP,0.4μmol/LRP,0.2μ/μltaq酶,模板1μl,1×反应缓冲液,0.3μmol/L的探针程序为:94℃3min;94℃20s;60℃:2min,读板,40循环。在MJresearch公司的option2定量PCR仪扩增,实验结果见图4。2结果2.1RNA的鉴定见图1。图1RNA电泳用紫外分光光度仪测到RNA的量为872ng/μl,OD260/280为1.90,电泳显示,RNA的质量较好。2.2PCR结果见图2。在200～400bp的地方能见274bp的片段。图2PCR产物电泳图2.3酶切结果见图3。在100～300bp的地方能见274bp的片段。图3酶切电泳图2.4将标准品在MJrearsh定量PCR仪上扩增,结果见图4,可见各梯度之间间隔的CT值相等,各梯度均能在一条直线上,标准曲线的相关系数在0.99以上,提示误差较小,可信度较高。图4定量PCR扩增结果3讨论自PCR发明之后人们一直企图用其进行核酸精确定量。1991年Holland等首先报道了运用不可延伸的寡核苷酸杂交探针与模板相结合,然后利用DNA聚合酶5′→3′核酸外切酶的活性将探针切断,使探针的能量传递结构破坏发出荧光来定量PCR产物。1992年Higuchi等在PCR反应管加入EB,随着反应的进行PCR产物的增加,EB与DNA双链结合发出荧光的强度也逐渐增加。他们运用摄影照相机进行连续照相,动态观察荧光强度的变化,根据荧光强度的大小来定量PCR产物的多少。这种方法虽然不太精确,但却是最早的实时定量PCR。1996年PE公司在Holland等运用方法的基础上开发出商用实时荧光定量PCR系列,即TaqmanPCR系列。实现了真正意义上的实时定量,使极微量核酸的精确定量成为可能。Heid等首先就其原理及方法进行了报道。之后,人们又设计出不同的荧光探针,如分子信标技术(molecularbeacon)、LightcyclerPCR等[2]。定量PCR技术现逐渐从病原体的检测逐步扩展到药理,法医学鉴定,分子生物学领域,随着它的推广应用,通过建立与目的片段一样的标准品,可以保证目的片段与标准品的扩增效率一致,减小实验误差,使定量PCR定量更加准确。本方法是一个简便,便宜,准确的制备标准品的方法,能满足实验室对标准品的大量需求,在实验中也取得较好的效果,与常规的从生物公司购买标准品相比此方案更可信,更能保证目的片段的扩增效率。参考文献:[1]张鋆.荧光实时定量PCR技术初探[J].生命科学趋势,2021,1(4):1[2]朱水芳.实时荧光聚合酶链反应(PCR)检测技术[M].北京:中国计量出版社,2021.1关于出版《重庆医学》(2021年增刊)一书暨“急慢性病的诊断与治疗”学术会征文通知为促进学术交流,推动临床医学的发展,使广大医药卫生科技人员的学术成果能及时地以学术论文的形式发表,缓解论文发表难的问题,本部拟于2021年5月、8月出版《重庆医学》增刊,并于2021年5月在海南省海口市、8月在..举办“急慢性病的诊断与治疗”学术交流会,邀请有关专家讲学。现将有征文处理及要求通知如下。1.征文经审稿录用者文章将刊登在《重庆医学》2021年(增刊)上(国际标准刊号ISSN1671-8348,全国统一刊号CN50-1079/R),并于2021年4月、7月发给学术会开会通知,参会者将获省级继续教育学分6分。2.文稿要求简明扼要(不用手写体),能用文字说明的尽量不用图表,征文字数控制在3000字以内,所用计量单位采用国际统一标准。有条件的作者可用Word文档存盘打印(投稿时要求附带软盘)。3.征文请寄:重庆市渝中区长江一路30号4楼《重庆医学》编辑部杨凌娅同志收。也可以发电子邮件至本部,E-mail:XCP@。邮编400014,电话:[phone]。征文稿件上请注明“海南会或.会征文”字样,并附作者详细通讯地址、联络电话。同时随征文在邮局用汇票邮汇审稿费20元,来稿恕不退还,请作者自留底稿。