实验二 植物病原菌的组织分离

实验二植物病原菌的组织分离实验二植物病原菌的组织分离、培养和纯化一、实验目的通过本次实验学习植物病原菌分离培养及纯化的原理和常用的方法。二、材料和用具玉米大斑病叶、灰斑病叶、苹果果实轮纹病及霉心病、甘薯黑斑病等材料，5%次氯酸钠溶液（有效氯为5%，见光分解，尤其紫外光，现用现配），75%酒精，剪刀，镊子，无菌水，灭菌培养皿，保鲜膜封口膜，记号笔、解剖刀，75%酒精小喷壶、酒精灯，打火机、、无菌滤纸、酒精棉、培养皿三、分离材料的选择为减少腐生菌的污染，分离所用的病害材料应尽可能新鲜，并且最好在病、健交接处选材取样。病、健交接处，除材料新鲜，污染的可能性小外，病原菌的生活力强、比较活跃，容易分离成功。四、植物病原菌的分离方法病原菌分离的方法因材料不同而异，植病实验室最常见的方法有组织分离法和稀释分离法两种。（一）.组织分离法：这种方法适用于大部分病菌的分离，此法又分为小块组织分离和大块组织分离两种方法。1、病斑类病原菌的分离（玉米大斑病病、灰斑病及苹果果实轮纹病的分离、甘薯黑斑病）（1）将无菌培养皿、镊子、无菌水、无菌滤纸、75%酒精小喷壶等放入无菌操作台，开紫外灯15分钟。期间融化培养基备用。（2）在操作台外，用酒精消毒双手，晾干。在操作台内再次消毒双手，晾干，将融化并冷却到50℃左右的PDA以无菌操作倒入培养皿8—10ml，在桌面上轻轻摇动，敞开盖，制成平，凝固后待用。（3）在操作台外，取分离材料，在病、健交界处剪取2—3毫米长的病组织。（4）在无菌条件下，用5%的次氯酸钠溶液消毒3-5min，（时间长短依病组织不同而异，处理种子约5—10分钟）。（5）用经过三次火焰灭菌的镊子将消毒的病叶移至无菌水中，漂洗3次，在滤纸上吸干水分，移至PDA平板培养基上，每皿可放均匀放3~4片，使材料与培养基紧密接触。倒置于25—28℃恒温箱内培养。（6）3~4天后，待菌落长出后挑取前缘菌丝，回接于PDA培养基上，在25℃温箱中培养，待菌落颜色变深后，在无菌条件下镜检是否是玉米大斑病菌、灰斑病菌、黑斑病菌、轮纹病菌，若仅有这几种病原菌的分生孢子，则说明已获得了纯培养，否则，则需要继续转至斜面培养基上进行纯化，直至获得纯培养。在4℃冰箱中保存。2、种子内部病原菌的分离（小麦根腐病菌的分离）选择典型的小麦黑胚粒3—4个，在70%的酒精中浸2—3秒钟后，以镊子夹住投入0.1%升汞溶液中表面消毒2—3分钟，然后取出小麦粒，以灭菌水冲洗3次，再移至已倒好的马铃薯琼脂平板培养基上，注意要以小麦的黑胚部位着靠在培养基上，倒置在25℃温箱中培养，待菌落长出后，挑取前缘菌丝于马铃薯斜面培养基上培养，培养3-4天后，无菌条件下镜检是否获得纯培养。3、病组织内部病原菌的分离（大豆枯萎病菌的分离）取大豆枯萎病病根沾取70%酒精，用酒精火焰三次消毒后，以在灯焰灭过菌的解剖刀切去表皮，然后切取其中小块变色的病组织，移植于培养基表面培养，每皿放3—4块，倒置于25℃温箱中培养2—3天。菌丝长出后转至马铃薯琼脂斜面培养基上，培养3-4天后，无菌条件下镜检是否获得纯培养。（二）.稀释分离法：稀释分离法适用于细菌、土壤菌及产生孢子多的真菌等病原菌的分离，本次实验以白菜软腐病作为材料进行分类离。白菜软腐病最易伴生腐生细菌，分离时需以病组织接种健康菜帮上，经数次转种予以纯化，其纯化方法是将菜帮经多次换水冲洗后，再用无菌水洗三次，切成适当大小，放在15厘米直径的培养皿中，菜帮下衬以吸水纸保温。用无菌解剖刀挑取病组织少许抹在菜帮的人为伤口上，培养在20—25℃下，经1天左右呈现腐烂，如此反复转种几次，至病斑纯净为止。分离时，在新的水烂斑边缘挑取少量病组织在无菌水试管中配成菌悬液，取灭菌培养皿3付，标好次序，其内各置无菌水1毫升，用移置环移取菌悬液一环，放在第1皿水中混合均匀，从中挑取一环稀释液至第2皿，再以同法稀释成第3皿，取熔化后冷至45℃左右的(一般将化好的培养基瓶靠近鼻尖，以不烫为度)牛肉膏蛋白胨培养基，每皿倒约15毫升，沿着桌面轻轻摇匀，凝固后倒置于26—28℃的温箱中培养，1—2日后可见白色，圆形或近圆形直径为1—2毫米的菌落，从中选典型菌落用移植环（划线法）移入牛肉膏蛋白胨斜面培养基上培养，每组转4—5管，注意过早出现的大型菌落多为腐生细菌。以上分离实验也可以划线法进行，方法是先取两付灭菌培养皿，每皿倒入约15毫升熔化的牛肉膏蛋白胨培养基，沿桌面轻轻摇匀，制成平板，然后用移置环沾取一环稀释好的菌悬液，在第一个培养皿平面培养基的左方长方形区内划平行线5—7条，再以此移置环继续向右(和左方小区内的几条平行线成一定角度)划5—7条平行线，依此法划两皿，倒置于26—28℃温箱中培养，1—2日后挑单个典型菌落移到斜面培养基上，培养待用。五、分离物的纯化有单孢分离法和连续稀释培养法。单孢分离法：无菌条件下，挑取适量已纯化菌株的孢子，表面划数条线，使孢子尽量分散，置于25℃培养一天后，在无菌条件下，将平皿置于双目解剖镜下找到单孢菌落，用无菌移菌环挑取单孢菌落，移到PDA培养基斜面上培养7—10天，即形成新的单孢菌株，再低温保存备用。连续稀释培养法，对病原真菌而言，就是切取典型菌落边缘含有菌丝的培养基小块，移植在平板培养基上。待其形成菌落后再次切取边缘菌丝、培养。这样连续进行数次，即可培养保存。对于病原细菌来说，则需要选择典型的菌落，。连续稀释培养，直至在培养皿中的菌落完全一致，才可培养保存。六、作业：1、每人上交分离到的纯菌种一支。2、每组上交分离到的各种病原菌一份七、思考题分离植物病原菌常用的方法有几种?这些方法适用于分离哪类病原菌?怎样分离?分离植物病原物时，为什么要选择新鲜病材料，并且在病健交界处取样?试分析分离工作成败的原因。注意事项：1、注意安全：酒精灯内酒精量应在1∕3—2∕3，应擦净灯外壁酒精；操作台上不要洒有酒精2、注意按照无菌操作程序工作。说明：1、本试验仅学习组织分离法中的病斑类病原菌组织分离（蓝色部分）。2、细菌类分离方法了解即可，不写入实验报告。1、2组一个操作台，3和4组、5和6组合用一个操作台