川中黑山羊OPN基因cDNA克隆及生物信息学分析

川中黑山羊OPN基因cDNA克隆及生物信息学分析胡亮，龙石太，吴宪红，等．川中黑山羊OPN基因cDNA克隆及生物信息学分析［J］．江苏农业科学，2021，42（5）：34－36．川中黑山羊OPN基因cDNA克隆及生物信息学分析胡亮，龙石太，吴宪红，王永，字向东（西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都610041）摘要：以川中黑山羊为研究对象，对OPN基因CDS区进行克隆测序及生物信息学分析，并与GenBank其他物种该基因进行序列比对，结果表明，川中黑山OPN基因全长952bp，包含1个834bp的完整的CDS编码区，编码278个氨基酸；OPN的CDS编码区核苷酸序列与绵羊、牛、猪、人、马、小鼠、鸡相应序列的同源性分别为98%、95%、79%、79%、70%、47%。关键词：川中黑山羊；OPN基因；克隆；生物信息学中图分类号：S827．3文献标志码：A文章编号：1002－1302（2021）05－0034－02收稿日期：2021－09－24基金项目：四川省应用基础项目（编号：2021JY0043）。作者简介：胡亮（1989—），女，重庆人，硕士研究生，从事动物遗传育种与繁殖研究。E－mail：[e-mail]。通信作者：字向东，硕士，教授，主要从事动物胚胎工程研究。E－mail：[e-mail]。山羊繁殖性能是山羊育种的重要指标，提高山羊窝产仔数对我国养羊业的可持续发展具有十分重要的意义。骨桥蛋白（osteopontin，OPN）是一种含精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸（ＲGD）序列的分泌型糖基化磷蛋白，能够介导骨组织细胞与骨基质的连接，属于细胞外基质蛋白［1］。OPN广泛存在于乳汁、子宫、胎盘中，具有多种生物学活性。OPN对雌性哺乳动物的繁殖过程有重要影响［2］。Fernandez等研究发现，骨桥蛋白对配子受精、受精卵卵裂、胚胎发育具有一定的刺激作用［3］。王振金等发现，OPN基因突变位点E341与奶山羊的生长发育性状有显著的关联效应［4］。OPN基因与猪排卵率、子宫长度密切相关。有研究发现，在梅山猪、大白猪、长白猪合成系的OPN位点存在13个等位基因，其中有5个等位基因与产仔数显著相关。张淑君等研究发现，OPN基因的标记位点与二花脸猪产仔数显著相关［5］。大河乌猪OPN基因存在8个基因型，且初产活仔数与二产活仔数在各基因型之间差异显著［6］。OPN基因对大长杂交一代母猪产仔数也有显著影响［7］。因此，开展OPN基因研究对于提高雌性动物繁殖性能、加快良种选育、更合理有效地开发利用品种资源具有重要意义。本试验以川中黑山羊为研究对象，对OPN基因CDS区进行克隆测序及生物信息学分析，并与GenBank其他物种该基因进行序列比对，在此基础上构建物种间分子系统进化树，旨在为川中黑山羊OPN基因的定位、表达调控研究提供依据。1材料与方法1．1材料在四川省乐至县天龙科技示范园采集1只成年川中黑山羊的卵巢，液氮冻存备用。动物组织总ＲNA提取试剂盒、2?TaqPCＲMasterMix、感受态细胞均购自上海天根生物科技有限公司；反转录试剂盒购自Fermentas（MBI）公司；X－Gal、IPTG、氨苄青霉素、克隆载体pMD－19Vector购自宝生物工程（大连）有限公司；DNA凝胶回收试剂盒购自爱思进生物技术（杭州）有限公司。1．2方法1．2．1引物设计及合成参照绵羊的OPN基因（GenBank登录号：NM_001009224.1）设计引物：F，5'－GGACTG-GACTCTTCTCTGCTGC－3'；Ｒ，5'－CCACCCTGCTTTAA-CATATCCT－3'，扩增片段全长952bp。引物序列送交上海英骏生物技术有限公司合成。1．2．2卵巢总ＲNA的提取、cDNA的合成提取川中黑山羊卵巢总ＲNA，采用Fermentas反转录试剂盒进行cDNA合成。1．2．3OPN基因的PCＲ扩增以反转录cDNA为模板进行PCＲ反应，反应体系为25μL：2?TaqPCＲMasterMix12．5μL，上、下游引物（20pmol/L）各1μL，cDNA模板0．5μL，ddH2O10μL。PCＲ反应条件为：95?预变性3min；94?变性30s，60?退火40s，72?延伸90s，35个循环；72?延伸5min。4?保存。1．2．4克隆及重组子筛选和鉴定PCＲ产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，按照DNA凝胶回收试剂盒说明书进行胶回收，回收产物与pMD－19Vector16?连接过夜。连接反应产物转化宿主菌大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素、X－Gal、IPTG的LB固体平板上，37?培养过夜。挑选白色单克隆菌落于LB液体培养基37?振荡培养12h，取菌液作PCＲ鉴定，产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测后，挑选阳性克隆菌液2mL送交上海英骏生物技术有限公司测序。1．2．5生物信息学分析利用软件DNAMAN将扩增获得的川中黑山羊OPN基因序列与GenBank中检索到的绵羊（NM_001009224．1）、牛（AF_492837．1）、猪（AK_234564．1）、人（DQ_846871．1）、小鼠（AF_515708．1）、鸡（M_59182．1）的相应区域进行核苷酸、氨基酸序列多重比对，构建物种分子进化树。用ProtParam程序（http：//web．expasy．org/protparam/）分析蛋白的一级结构及其理化参数；用ProtScale程序（http：//expasy．org/tools/protscale．html）进行疏水性分析；用TM-HMMServerV．2．0（http：//genome．cbs．dtu．dk/services/TM-HMM－2．0/）进行跨膜区预测；用SignalP4．0Server（http：//genome．cbs．Dtu．dk/ser－vices/SignalP/）预测信号肽；用—43—江苏农业科学2021年第42卷第5期PSOＲT（http：//psort．hgc．jp/form．html）进行亚细胞定位预测；用NetPhos2．0（http：//．cbs．dtu．dk/services/Net-Phos/）预测磷酸化位点；用NetOGlyc（http：//．cbs．dtu．dk/services/）预测糖基化位点；用GOＲ（http：//npsa－pbil．ibcp．fr/cgibin/npsaautomat．pl？page=npsa_gor4．html）预测蛋白质二级结构。2结果与分析2．1OPN基因PCＲ扩增结果吸取4μLOPN基因扩增产物，对其进行电泳检测。用1%琼脂糖凝胶电泳检测条带，结果如图1所示，其中第1个泳道为DL2021DNAMarker，第2、第3泳道为OPN基因目的条带，与预期大小950bp基本一致，且目的条带明亮，有利于后续试验的进行。2．2川中黑山羊OPN基因的核苷酸序列分析利用DNAMAN对测序结果进行拼接得到952bp片段，与预期相符。用OＲF查找器（http：//．ncbi．nlm．nih．gov/gorf/gorf．html）查找OPN的开放性阅读框并翻译出氨基酸序列，结果表明，OPN基因起始密码子为ATG（编码蛋氨酸），终止密码子为TGA（不编码氨基酸），编码278个氨基酸。在GenBank上发表该序列，登录号为KF699859。利用DNAMAN分析川中黑山羊与其他物种OPN基因CDS区的核苷酸序列同源性，结果显示，川中黑山羊与绵羊、牛、猪、人、小鼠、鸡的同源性分别为98%、95%、79%、79%、70%、47%，说明OPN基因进化相对保守。同时用ClustalX、MEGA4．0等软件对川中黑山羊、牛、马、猪、人、黑猩猩、大鼠、小鼠的核苷酸序列采用邻接法（NJ）及最大简约法（MP）分别构建物种间分子系统进化树（图2、图3），结果表明，2种方法构建的物种间分子系统进化树结果基本一致，且川中黑山羊与绵羊的关系最近，符合进化关系。2．3川中黑山羊OPN蛋白的结构特征分析生物信息学分析结果表明，川中黑山羊OPN蛋白的分子式为C1310H2051N371O496S4，相对分子质量为311062．1，理论等电点（PI）为4．49，半衰期为30h，脂肪系数为53．35，不稳定参数为64．57，属于不稳定蛋白。OPN蛋白为亲水性蛋白，信号肽长度为16个氨基酸残基，切入位点在丙氨酸与亮氨酸之间，属于分泌型蛋白。OPN成熟肽没有跨膜区，成熟蛋白位于细胞外的概率是0．820。OPN多肽有46个磷酸化位点，分别为Ser（39）、Thr（7）、Tyr（0）。OPN多肽有1个N－糖基化位点（101位）、2个O－糖基化位点（49位、81位）。OPN蛋白α螺旋（73个氨基酸残基）、延伸链（30个氨基酸残基）、无规卷曲（175个氨基酸残基）分别占靶蛋白的26．2%、10.8%、63．0%。3结论与讨论在分子水平上，OPN几乎参加了生殖全过程，包括受精、胚泡着床及胎盘形成等［8］。OPN基因第6内含子存在由305bp片段缺失而造成的多态，Lin等证实了此多态性与母畜窝产仔数等繁殖性能显著相关［9］。本试验通过PCＲ技术从川中黑山羊卵巢组织中克隆得到了952bpOPN基因cDNA序列，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA，符合大多数真核生物起始密码子具有的结构特征。经同源性比对可知，川中黑山羊与绵羊、牛OPN基因的CDS序列一致性分别达到98%、95%。从OPN基因编码区分子系统进化树可以看出，川中黑山羊与绵羊聚为一支，与其他哺乳动物的遗传距离相对较小，与鸡的遗传距离最远，符合物种的遗传进化规律。本试验克隆测序获得了OPN基因的编码区全长cDNA序列，并运用生物信息学相关软件对该基因及编码蛋白进行序列与蛋白分析，预测了OPN基因所编码蛋白结构的位置，为日后开展山羊繁殖性状研究以及进一步研究OPN基因的表达、转录调控奠定了理论基础。参考文献：［1］吴井生，朱孟玲，陈超，等．影响猪繁殖性能的候选基因OPN的研究进展［J］．四川畜牧兽医，2021（2）：31－32．［2］KimS，ShinT．Immunohistochemicalstudyofosteopontininboartes-tis［J］．JVetSci，2021，8（2）：107－110．［3］FernandezMS，EscobarC，LavelinI，etal．Lacalizationofosteopontininoviducttissueandeggshellduringdifferentstagesoftheavianegglayingcycle［J］．JStructuralBiol，2021，143（3）：171－180．—53—江苏农业科学2021年第42卷第5期櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄［4］王振金，王建民，王桂芝，等．崂山奶山羊骨桥蛋白基因（OPN）部分片段多态性及其与生产性状的关联分析［J］．农业生物技术学报，2021，20（10）：1168－1177．［5］张淑君，熊远著，曾凡同，等．猪八号染色体产仔数微卫星标记的探讨［J］．养猪，2021（2）：31－33．［6］尚帮华，杨婷，连林生，等．骨调素基因多态性及其与大河乌猪繁殖性状相关分析的研究［J］．云南农业大学学报，2021，22（6）：843－846．［7］孙敬礼，武磊，黄涛，等．OPN和BMP15基因与大长杂交一代母猪产仔数的关系［J］．猪业科学，2021（4）：90－92．［8］HigashibataY，SakumaT，KawahataH，etal．Identificationofpromoterregionsinvolvedincellanddevelopmentalstage－specificosteopontinexpressioninbone，kidney，placenta，andmammarygland：ananalysisoftransge