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平邑甜茶非共生血红蛋白基因GLB1的克隆_表达及转化研究山东农业科学2021,6:5~9ShandongAgriculturalSciences收稿日期:2021-03-02基金项目:山东省自然科学基金资助项目(Y2021D08);十一五科技支撑重点项目(2021BADA4B05)作者简介:史兴征(1986-),女,硕士研究生,研究方向为果树生理。E-mai:lshixingzheng2021@163com*通讯作者,E-mai:lpft@sdaueducn平邑甜茶非共生血红蛋白基因GLB1的克隆、表达及转化研究史兴征,彭福田*,王新亮,王兆燕,赵玉(山东农业大学园艺科学与工程学院/作物生物学国家重点实验室,山东泰安271018)摘要:根据GenBank上苹果GLB1基因的EST序列设计引物,利用PCR技术克隆到平邑甜茶GLB1同源基因MhGLB1(GenBank注册号:GQ423619),该基因包含一个477bp的开放阅读框,编码158个氨基酸,分子量为178ku。成功构建了35SMhGLB1正义表达载体,并对S以12粉番茄进行农杆菌介导的遗传转化。荧光定量PCR结果显示,MhGLB1在根、茎、叶中均有所表达,但在根中的表达量最高;NO-3和SNP处理能够诱导根中MhGLB1的表达。关键词:平邑甜茶;MhGLB1;基因克隆;转基因中图分类号:Q78;S6614文献标识号:A文章编号:1001-4942(2021)06-0005-05StudyonCloning,ExpressionandTransformationofNonsymbioticHemoglobinGeneGLB1fromMalushupehensisRehdSHIXing-zheng,PENGFu-tian*,WANGXin-liang,WANGZhao-yan,ZHAOYu(CollegeofHorticultureScienceandEngineering,ShandongAgriculturalUniversity/StateKeyLaboratoryofCropBiology,Taian271018,China)AbstractBasedontheESTsequenceofGLB1fromappleinGenBank,theprimersweredesignedforPCR,andthenthegeneMhGLB1wasclonedfromMalushupehensis,whoseaccessionnumberwasGQ423619inGenBankThefull-lengthcDNAcontaineda477bpopenreadingframeencodinga178kuproteinwith158aminoacidsItssenseexpressionvectorwasalsoconstructedas35SMhGLB1,whichcouldbesuccessfullyusedforgenetictransformationmediatedbyAgrobacteriumtumefaciensintotomatoThequantitativereal-timePCRanalysisshowedthatMhGLB1expressedinroots,stemsandleavesofMalushupehensis,buttheexpressionlevelwasthehighestinrootsThetreatmentsofNO-3andSNPcouldinduceitsexpressioninrootsKeywordsMalushupehensis;MhGLB1;Genecloning;Transgene血红蛋白(Hemoglobins,Hbs)最初是在动物中发现的,在血液中起运输氧气、维持血液酸碱平衡、活化组织细胞、增强自身免疫、抗菌等功能[1]。而植物血红蛋白发现的较晚,1939年Kubo首次在豆科植物固氮根瘤中发现了血红蛋白,后来人们把它定名为豆血红蛋白。之后,Appleby等从一种与根瘤菌共生的榆科植物Parasponiaandersonii中分离出植物Hbs,并证实Pandersonii拥有一个编码共生、非共生Hbs的双重功能基因。后来,Landsmann等在非豆科植物山麻黄中发现了Hbs的表达。进一步的研究证实,单子叶植物大麦及其他禾本科植物如玉米、小麦、黑麦、水稻中也存在植物Hbs。这些发现表明植物血红蛋白在植物中广泛存在,而并非仅限于豆科植物,并可能具有共生固氮以外的功能。平邑甜茶(MalushupehensisRehdvarpingyiensisJiang)是我国特有的植物种,广泛用作苹果砧木;它具有高度无融合生殖能力,实生苗个体一致性非常好,易于检测处理间的差异。本文以平邑甜茶一年生实生苗新根为试材,成功克隆了MhGLB1全长基因,并构建了正义表达载体,利用农杆菌介导的方法进行了S以12粉番茄的遗传转化,为进一步探索平邑甜茶MhGLB1基因在平邑甜茶生长发育中的作用奠定基础。同时利用荧光定量PCR法测定了MhGLB1在平邑甜菜根、茎、叶中的表达。1材料与方法11材料、菌种及试剂平邑甜茶新鲜幼根采自一年生实生苗,采集后的幼根经清洁处理后置-70C保存备用。基因转化受体为S以12粉番茄。大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5和农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)LBA4404菌株、植物表达载体PBI121由本实验室保存;DEPC、Tris等RNA提取试剂为上海生工生物工程公司产品;限制性内切酶、TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、胶回收试剂盒、Marker、pMD18-Tvector购自宝生物工程(大连)有限公司;DNA测序与引物合成由Invitrogen公司完成。12MhGLB1全长基因PCR扩增平邑甜茶新根中总RNA的提取采用CTAB法(Chang等,1993)进行,按照SMARTTMRACEcDNAAmplicatingKit的说明书进行cDNA第一条链的合成。根据GenBank上苹果GLB1基因的EST序列(AY224132),设计特异引物(上游引物sp1:5-GCGGATCCATGGAAGGCAAAGTTTTC-3,下游引物sp2:5-GCGAGCTCCTAATTAAGGGGAGGCTTCAT-3)进行PCR扩增。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳后,按照琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明回收目的片段。回收的PCR产物与pMD18-T载体16连接4h,转化大肠杆菌DH5,对Ampicillin(Amp)抗性的转化菌落进行PCR检测,筛选出的阳性克隆进行测序。13MhGLB1正义表达载体的构建以含有MhGLB1编码区序列的pMD18-T载体为模板,用引物M13-48和sp2进行PCR扩增,筛选出含有MhGLB1编码区正向插入pMD18-T载体的菌落,采用碱裂解法提取质粒,用BamH和Sal进行双酶切,反应条件是37、3h,经1%的琼脂糖凝胶电泳,回收MhGLB1目的基因。同时,用BamH和Sal双酶切植物表达载体PBI121,电泳回收载体片段。回收的MhGLB1目的基因与PBI121在T4DNA连接酶的作用下连接过夜,转化大肠杆菌DH5,通过PCR和双酶切进行鉴定。14番茄的遗传转化利用冻融法将构建的植物表达载体导入农杆菌LBA4404,再通过农杆菌介导叶盘法(王关林和方宏筠,2021)转化S以12粉番茄。PCR检测阳性的再生植株移至田间进行常规栽培。15荧光定量PCR取平邑甜茶种子,消毒层积后,播于洗净消毒的河沙中。当幼苗第6片真叶刚出现时,将其转移到含10mmol/LKNO3的Hoagland营养液中处理2、6、12h,以KCl或NH4Cl作对照;于含1mmol/LSNP(硝普钠)的Hoagland营养液中处理2、4、8h;低氧胁迫下处理12、24h,然后将根、茎、叶分离后迅速用液氮冷冻后置于-80保存备用。采用TaqMan探针法进行荧光定量PCR反应,使用PrimerExpress软件设计引物和探针。引物GLB1-F:CGCATTGTTGGAAACCATAAAG,GLB1-R:TCATAAGCTTCTCCCCATGCA。探针:fma+AGGCCTTACCGGAAATGTGGTCA+tamra。以18SrRNA作为管家基因。2结果与分析21MhGLB1编码基因克隆及同源性分析以平邑甜茶新根cDNA为模板,采用PCR扩增得到一个477bp的产物(图1)。该基因编码158个氨基酸,分子量为178ku。利用CLUSTALXver18软件()将拟南芥、玉米、大麦、番茄、棉花等其它植物GLB1基因与MhGLB1的氨基酸序列进行系统进化树分析,发现MhGLB1与梨GLB1的同源关系最近(图2)。用DNAMAN软件分析,平邑甜茶MhGLB1氨基酸序列与梨GLB1基因有9557%的同源性。平邑甜茶与其它6山东农业科学2021年植物血红蛋白氨基酸序列的同源性分析见表1。M:标准分子量;1、2:PCR产物图1MhGLB1编码区注:括号内为GenBank登录号。图2MhGLB1与其它植物GLB1基因的进化树分析表1平邑甜茶与其它植物血红蛋白氨基酸序列的同源性比较植物种类编码氨基酸数(个)序列同源性(%)GenBank登录号平邑甜茶158100GQ423619葡萄1687694XM_002284648梨1589557AY224133橘子1836576AY026338拟南芥1607640NM_127165番茄1527532AY026343马铃薯1527468AY151389苜蓿1608012Q9FVL0大麦1627301Q42831小麦1627117AY151390玉米1527169NM_001111496水稻1696765NM_001055972棉花1638282AY899302大豆1617950U4714322MhGLB1正义表达载体的构建及番茄的遗传转化将构建的表达载体用BamH和Sal双酶切,酶切结果表明MhGLB1已经插入到PBI121载体中。将含有重组质粒的菌落进行PCR扩增,扩增产物进行测序,测序结果与MhGLB1的编码区序列完全一致,表明表达载体构建成功。将构建好的PBI121-MhGLB1重组质粒经冻融法转入农杆菌LBA4404中。叶盘法转化番茄S以12粉,对得到的7棵抗性植株进行PCR检测(上游引物:35S,下游引物:sp2),有5株转基因植株通过PCR扩增出与阳性对照同样大小的片段,而未转化植株则无特异性扩增条带,初步证明MhGLB1基因已经转入番茄植株的基因组中,部分检测结果如图3。PCR检测呈阳性的幼苗移至田间栽培。M:标准分子量;1~7:转基因番茄;WT:未转基因番茄图3转MhGLB1基因番茄再生植株的PCR检测23荧光定量PCR采用荧光定量PCR方法分析MhGLB1的表达特性。结果显示,MhGLB1在根、茎、叶中均有表达且在根中的表达量最高(图4)。由图5可以看出,NO-3处理能诱导MhGLB1在根、茎、叶中的表达。由图6可以看出,SNP能够诱导MhGLB1在根中的表达。图4荧光定量PCR分析MhGLB1在不同组织中的表达7第6期史兴征等:平邑甜茶非共生血红蛋白基因GLB1的克隆、表达及转化研究图5荧光定量PCR分析NO-3处理对MhGLB1表达的影响图6荧光定量PCR分析SNP处理对MhGLB1在根中表达的影响3讨论与结论1997年Trevaskis克隆了拟南芥的两个血红蛋白基因AtGLB1、AtGLB2。低氧胁迫下,AtGLB1在根和叶中都有表达;AtGLB2受低温的诱导在叶中有少量表达。本研究中以平邑甜茶新根为材料成功克隆了GLB1的同源基因MhGLB1。系统进化树分析显示MhGLB1与梨的GLB1基因的同源关系最近。为了确定MhGLB1的功能及表达方式,成功构建了35SMhGLB1正义表达载体,并对S以12粉番茄