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食品标准网（）SN0296-1993出口禽肉中莫能菌素残留量检验方法生物自显影法1994年5月1日实施1主题内容与适用范围本标准规定了出口禽肉中莫能菌素残留量的抽样、制样和生物自显影测定法。本标准适用于出口冻鸡中莫能菌素残留量的检验。2抽样和制样2.1检验批以不超过2500件商品为一检验批。同一检验批的商品应具有相同特征,如包装、标记、产地、规格和等级等。2.2抽样数量2.3抽样方法按2.2规定的抽样件数随机抽取,逐件开启。每件至少取一袋作为原始样品,原始样品总量不少于2kg,放入清洁容器内,加封后标明标记,及时送交实验室。2.4样品制备从每袋原始样品中取出部分有代表性样品,将可食部分放入高速组织捣碎机中捣碎均匀,充分混匀,用四分法缩分出不少于1kg试样。装入清洁容器内,加封后标明标记。2.5样品保存将试样于—18℃冷冻保存。注：在抽样及制样过程中,必须防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。3测定方法3.1方法提要用甲醇提取肉样中莫能菌素,经四氯化碳萃取后浓缩至干,以甲醇溶解残留物,用薄层分离,再用生物自显影法测定。3.2设备和材料3.2.1微量注射器：50μL。3.2.2薄层板：硅胶,Q/YT257—85SG,5cm×20cm,使用前110℃活化2h。3.2.3展开缸：240mm×57mm×32mm。3.2.4游标卡尺：测量范围0～200mm,精度0.02mm或使用抑菌圈测量仪测量。3.2.5离心机：转速3000r/min。3.2.6旋转浓缩器。3.2.7恒温培养箱：37±1℃。3.2.8高压灭菌器。3.2.9长方形培养皿：20cm×10cm×5cm。1食品标准网（）3.2.10均质器：带均质杯250mL。3.3试剂和培养基3.3.1试剂3.3.1.1甲醇：分析纯。3.3.1.2四氯化碳：分析纯。3.3.1.3乙酸乙酯:分析纯。3.3.1.4莫能菌素标准品:960μg(效价)/mg(中国兽药监察所提供)。3.3.1.5试验菌种：枯草杆菌(Bacillussubtilis),菌种号ATCC6633(卫生部药品生物制品检定所提供)。3.3.2培养基3.3.2.1菌种用培养基(见附录A第A1章)。3.3.2.2生物自显影用培养基(见附录A第A2章)。3.3.2.3肉汤培养基(见附录A第A3章)。3.4测定步骤3.4.1工作液制备3.4.1.1莫能菌素标准贮备液准确称取适量的莫能菌素标准品,用甲醇溶解配制成浓度为500μg(效价)/mL的莫能菌素标准溶液。配制后于冰箱中保存,一周内使用。3.4.1.2莫能菌素标准工作液吸取标准贮备液,用甲醇分别稀释成2,3,4,5,10和15μg(效价)/mL的标准工作标准液。以上稀释液均须当日配制。3.4.1.3菌种培养及芽胞菌悬浮液制备将菌种安瓿瓶的上部消毒后敲碎,加入少量肉汤培养基,使其溶解并移至肉汤管中混匀。置37±1℃温箱中培养24h。将培养物接种于菌种培养基中,置于37±1℃培养一周,镜检含芽胞菌数达85%以上,便可制备芽胞悬浮液。用适量灭菌生理盐水冲洗菌苔,然后将该菌液转移至离心管中,充分摇匀后,于3000r/min离心30min,弃去上清液,再加入同样量的灭菌生理盐水重复离心一次。弃去上清液,再加入适量灭菌生理盐水,摇匀后于65℃水浴中加热30min,然后,于1000r/min离心5min,取上清液并转入灭菌试管中,即为芽胞菌悬浮液,置于冰箱中保存,可使用一个月。3.4.2试液制备：准确称取绞碎试样10g(精确至0.1g)于均质杯中,加入20mL甲醇,均质2min后,移入离心管中,于3000r/min离心20min。取其上清液15mL,转入盛有5mL蒸馏水的250mL分液漏斗中,混合后加入10mL四氯化碳,充分振摇,静置分层,放出四氯化碳层于150mL茄形瓶中。用四氯化碳再重复提取两次,合并四氯化碳至上述茄形瓶中,于50～60℃水浴中用旋转蒸发器浓缩至干,加入0.5mL甲醇溶解残留物供TLC实验用。此样液中相当于禽肉试样浓度为15g/mL。3.4.3测定3.4.3.1生物自显影将每个样品及标准溶液分别点在四块薄层板上,先于每块薄层板下端2cm处划一条基线,然后在这条基线上分别点20μL试液和3μg(效价)/mL莫能菌素标准溶液,试液和标准溶液点相距2.5cm。在展开缸中用乙酸乙酯进行展开,直至溶剂前沿线距板顶端1.5cm处为止,取出薄层板,风干后备培养用。将薄层板水平置于高压灭菌的长方形培养皿中,无菌操作将已熔化并冷却至50～55℃的生物自显影用培养基均匀地喷在其表面上,然后用10mL上述接种芽胞菌悬液的培养基铺满整个薄层板,保持水平,待其凝固,于37±1℃培养18h。3.4.3.2对照试验除不加试样外,按上述测定步骤进行。2食品标准网（）3.5结果计算和表述经过培养后,在薄层板上与莫能菌素标准液产生抑菌圈的Rf值(约0.38)相同位置上,显现抑菌圈者即为阳性。当样品判定为阳性时,测量四块薄层板上的试液及标准溶液产生的抑菌圈直径,分别计算出平均值。当每组四个直径值的相对标准偏差(RSD)均不超过5%时,并且试液的抑菌圈直径与标准溶液(20μL)的抑菌圈直径近似(直径相差不超过±1mm),则其样品中莫能菌素含量按下式计算：cX＝──m式中：X——样品中莫能菌素的含量,mg/kg；c——试验中所用的标准溶液的浓度,μg/mL；m——最终试液所代表的禽肉试样的浓度,g/mL。4测定低限、回收率4.1测定低限本方法测定低限为0.20mg(效价)/kg。4.2回收率回收率的实验数据:莫能菌素浓度在0.20～0.67mg(效价)/kg范围内,回收率为81%～100%。附录A培养基成分及制备方法(补充件)A1菌种用培养基蛋白胨10.0g牛肉浸膏5.0g氯化钠2.5g琼脂15.0g蒸馏水1000mL将上述各成分于蒸馏水中加热溶解,用1mol/L氢氧化钠溶液或10%盐酸调节pH,使其灭菌后pH为6.5±0.1,分装于试管或克氏瓶内,于121℃15min高压灭菌,灭菌后制备成所需斜面备用。A2生物自显影用培养基蛋白胨10.0g酵母浸膏2.5g葡萄糖10.0g琼脂15.0g蒸馏水1000mL将上述各成分于蒸馏水中加热溶解,用1mol/L氢氧化钠溶液或10%盐酸调节pH,使其灭菌后pH为6.0±0.1,分装于锥形瓶内,于121??5min高压灭菌,备用。A3肉汤培养基蛋白胨10.0g牛肉浸膏5.0g氯化钠2.5g蒸馏水1000mL将上述各成分于蒸馏水中加热溶解,用1mol/L氢氧化钠溶液或10%盐酸调节pH,使其灭菌后pH为7.0±0.1,分装于试管中,于121℃15min高压灭菌。3食品标准网（）附加说明:本标准由中华人民共和国国家进出口商品检验局提出。本标准由中华人民共和国天津进出口商品检验局负责起草。本标准主要起草人袁而森、王素琴、李剑影。本标准等同采用日本厚生省检验方法：畜水产食品中の残留物质检查法(1990)。4