(完整版)治疗自身免疫性疾病的新靶标及相关新药研发

治疗自身免疫性疾病的新靶标和相关新药研发•治疗自身免疫性疾病的新靶标：Kv1.3通道•靶向Kv1.3通道的先导药物研发•靶向Kv1.3先导药物在预防和治疗自身免疫疾病中的应用自身免疫疾病自身免疫性疾病（autoimmunediseases）是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病。系统性自身免疫病（非器官特异性）器官特异性自身免疫病系统性红斑狼疮(systemiclupuserythematosus)类风湿性关节炎（rheumatoidarthritis）口眼干燥综合征(Sjogren'ssyndrome)结节性多发性动脉炎(polyarteritisnodosa)慢性淋巴细胞性甲状腺炎(Hashimoto'sthyroiditis)多发性硬化症(multiplesclerosis)重症肌无力(myastheniagravis)胰岛素依赖型糖尿病(insulin-dependentdiabetesmellitus)临床上主要的自身免疫病及其相关证据直接证据间接证据疾病自身抗体传递疾病母体输入传递动物SCLD小鼠中输入细胞引起疾病自身抗原在实验动物中诱发疾病病变中证实有抗体或T细胞(抗体　T细胞)实验动物中输入淋巴细胞引起疾病动物模型证实有自身抗体或自身反应性T细胞器官特异性重症肌无力++　++++甲状腺机能亢进+++++桥本甲状腺炎　　+　++　　　++胰岛素依赖性糖尿病+++恶性贫血+艾迪森病+天疱疮+++原发性胆汁肝硬化+多发性硬化症(+)++非器官特异性自身免疫溶血性贫血+++特发性血小板减少症+++++肺肾综合征++++类风湿关节炎+++++干燥综合征++系统性红斑狼疮+++++硬皮病++++肌皮病+人类自身免疫病的致病性自身抗原疾病　　　　　自身抗原桥本甲状腺炎甲状腺球蛋白原发性粘液水肿第二胶体抗原（CA2）、胞质微粒体、细胞膜甲状腺功能亢进症细胞表面TSH受体恶性贫血内因子、壁细胞微粒体艾迪森病肾上腺细胞胞质过早停经类固醇产生细胞胞质男性不育精子胰岛素依赖性糖尿病胰岛细胞胞质、细胞表面物质多发性硬化症脑肺肾综合征肾小球和肺血管基膜寻常天疱疮上皮棘细胞间的桥粒类天疱疮基膜晶状体源性色素膜炎晶状体交感性眼炎眼色素膜重症肌无力骨骼肌和心肌中乙酰胆碱受体自身免疫性溶血性贫血红细胞原发性血小板减少性紫癜血小板原发性胆汁性肝硬化线粒体（主要）慢性活动性肝炎平滑肌、细胞核、细胞表面蛋白溃汤性结肠炎结肠脂多糖干燥综合征腺管、线粒体、细胞核、甲状腺、IgG类风湿关节炎IgG、类风湿关节炎相关核抗原（RANA）、胶原蛋白盘状型红斑狼疮细胞核肌皮病IgG硬皮病可提取的细胞核混合结缔组织病DNA系统性红斑狼疮核蛋白、细胞质中可溶性抗原、其他抗原：血液中有形成分、凝血因子、华氏抗原全球有5-8%的人口受到约40种自身免疫疾病的威胁！自身免疫疾病已被我国列为“十大”严重影响人民健康的疾病之一。系统性红斑狼疮类风湿性关节炎多发性硬化症自身免疫病的共同特征1、多数自身免疫性疾病病因不明；2、患者女性多见，发病率随年龄增高，有遗传倾向；3、存在自身抗体和（或）自身反应性T细胞；4、疾病的重叠现象；5、病程迁延，发作与缓解交替；6、免疫抑制剂治疗有一定疗效•自身抗原的出现隐蔽抗原的释放、自身抗原发生改变•免疫调节异常淋巴细胞的多克隆激活、Th1和Th2细胞功能失调•交叉抗原链球菌感染、EB病毒感染、柯萨奇病毒感染•表位扩展•遗传因素发病机制免疫耐受性的终止和破坏是自身免疫病发生的根本机制。确切原因尚未完全阐明，可能与下列因素有关：发病机制治疗策略免疫抑制剂•皮质激素：强的松，可的松•细胞毒性药物：烷化剂，嘌呤拮抗剂等抗感染•抗菌素：环孢子菌素、氯霉素细胞因子及受体抗体或阻断剂•生物学制剂：抗淋巴细胞球蛋白、细胞因子单抗、细胞因子受体拮抗剂缺点：不能根治，且对肝脏和肾脏有毒性，长期使用有致感染和致癌作用，导致不育和畸形，副作用强理想的治疗策略：选择性的抑制自身免疫而不影响正常免疫功能，毒副作用弱T细胞引起自身免疫的信号通路T细胞和自身免疫疾病选择性抑制T细胞的激活和增殖的免疫抑制剂可以有效的治疗自身免疫疾病。•电压门控钾通道亚型Kv1.3•中等电导钙激活钾通道(IKCa1)T细胞中的钾离子通道与钾通道Kv1.3和IKCa1相关的T细胞激活过程T细胞的分类根据T细胞表面CD45分子，将T细胞分为二个新亚群。凡未经抗原刺激的T细胞可称之为原始T细胞（naiveTcell,Tn）为CD45RA+T细胞群，而经抗原刺激分化为记忆T细胞（memoryTcell,Tm）为CD45RO+细胞群。特性TnTmCD45CD45RACD45RO归巢受休表达高水平低水平粘附分子表达低水平高水平再循环血流→淋巴组织直接移行至抗原部位寿命短（数日）长（数月）再次抗原刺激-+++T细胞的分类记忆T细胞（memoryTcell,Tm）根据其表面受体CCR7分子的表达和功能不同，可分为TEM（CCR7-）和TCM（CCR7+）细胞。钾通道Kv1.3和IKCa1在不同T细胞中的表达钾离子通道2003年诺贝尔奖钾离子通道是一类细胞膜上选择性允许K+跨膜通过的离子通道，是继G-蛋白偶联受体和蛋白激酶之后的第三大信号转导分子家族。治疗自身免疫疾病的新靶标：钾通道Kv1.3钾通道Kv1.3结构示意图TEM细胞的异常增殖在自身免疫疾病中起重要的作用，钾通道Kv1.3成为了治疗自身免疫疾病的一个新的药物靶标。•治疗自身免疫性疾病的新靶标：Kv1.3通道•靶向Kv1.3通道的先导药物研发•靶向Kv1.3先导药物在预防和治疗自身免疫疾病中的应用有机小分子调节剂的筛选与设计靶向钾通道Kv1.3的药物研发多肽调节剂的筛选与设计有机小分子调节剂的筛选与设计1998年，Merck公司就分离到correolide，它能在100nM水平上抑制T细胞的增殖。随后Merck、Pfzer等研发机构分离、合成、和功能鉴定了10多种有机小分子药物候选物。有机小分子先导药物的不足：作用于Kv1.3钾通道的选择性和特异性不强有机小分子的药理学活性有机小分子调节剂的筛选与设计多肽调节剂的筛选与设计自然界中的有毒动物多肽药物的筛选与设计以蝎毒肽为基础的多肽药物筛选与设计以海葵毒素为基础的多肽药物筛选与设计海葵毒素多肽药物的研发选择性较好的SL5多肽药理学活性海葵毒素Shk海葵多肽调节剂的筛选与设计自然界中的有毒动物多肽药物的筛选与设计以蝎毒肽为基础的多肽药物筛选与设计以海葵毒素为基础的多肽药物筛选与设计以蝎毒肽为基础的药物研发作为天然的毒素资源库，蝎毒肽比海葵毒素更丰富。蝎作用于钾离子通道的蝎毒肽如何获得对钾通道Kv1.3高选择性和特异性的多肽调节剂？•从蝎毒肽中天然分离•以蝎毒肽为模板进行设计和改造天然的蝎毒肽包含多种作用于Kv1.3通道的成员，但选择性和特异性普遍不高。ImKTx88的筛选和序列分析从海南斑等蝎（Isometrusmaculates）毒腺组织cDNA文库中筛选出钾通道蝎毒肽ImKTx88基因。天然蝎毒肽调节剂的筛选多肽ImKTx88的表达纯化和质谱鉴定2005年，法国科学家Jean-Marc等改造蝎钾毒素多肽OSK1获得了特异作用于Kv1.3通道的多肽AOSK1。以蝎毒肽为模板的多肽调节剂设计和改造AOSK1及其突变体对Kv1.3的特异性和选择性比较2008年，武汉大学依据已建立的多种蝎毒腺cDNA文库，结合蝎毒肽的结构与功能研究，设计筛选获得了选择性和特异性作用于Kv1.3通道的多肽ADWX-1。靶向钾通道Kv1.3先导药物多肽ADWX-1的筛选α-KTx3亚家族蝎毒肽序列比对BmKTX结构蝎毒肽和Kv1.x钾通道作用模式先导药物多肽ADWX-1的设计先导药物多肽ADWX-1的设计ADWX-1和BmKTX的序列比对及其和Kv1.3通道作用ADWX-1和rBmKTX的圆二色谱比较ADWX-1和BmKTX的NMR结构比较ADWX-1多肽的表达纯化PeptideChannelsandcellstestedKd-IC50xm(nM)SpecificityIndexxm/cnn=Kv1.3CharybdotoxinhKv1.3TlymphrKv1.1oocyterKv1.2B823.59991011002.9KaliotoxinrKv1.3oocytemKv1.1oocytemKv1.2oocyte0.411.12512.761OSK1[P12,K16,D20]mKv1.3mKv1.1COShKv1.2COS0.0593.181001541000AnuroctoxinhKv1.3TlymphhKv1.1L929hKv1.2COS0.731006.111008.34ShK(L5)hKv1.3TlymphmKv1.1rKv1.2B820.0767.048192100ADWX-1mKv1.3HEKmKv1.1HEKhKv1.2HEK0.0020.651001300100000ADWX-1与Kv1.3通道作用的机制？•设计ADWX-1的丙氨酸扫描突变体•测定突变体的药理学活性•生物信息学模建复合物结构ADWX-1的突变体设计ADWX-1突变体二级结构分析突变体对Kv1.3通道的药理学活性ADWX-1mutantIC50(pM)nIC50(mut)/IC50(wt)Wildtype1.89±0.53131.0R11A336.3±49.18177.9R23A7344.2±395043885.8F24A4013.4±85742123.4K26A967.4±7264511.8T28A58.2±6.5430.8N29A454.4±40.76240.4H33A77.2±37.4340.8T35A28.0±19.2414.8ADWX-1-Kv1.3复合物结构ADWX-1突变体计算机丙氨酸扫描结果和实验结果的比较ADWX-1与Kv1.3通道作用的分子机制ADWX-1与Kv1.3通道作用的分子机制在ADWX-1和Kv1.3通道的相互作用中，ADWX-1中的Arg23，Phe24和Lys26是最重要的功能氨基酸残基。Arg23，Lys26和Kv1.3的相互作用Phe24和Kv1.3的相互作用Arg23，Phe24，Lys26和Kv1.3的相互作用有机小分子和多肽调节剂的比较有机小分子correolide与Kv1.3通道的相互作用多肽KTX与Kv1.3通道的相互作用Kv1.x通道序列比对、通道模型及药物分子作用区域示意图小分子和多肽作用Kv1.3通道的示意图与有机小分子药物相比，多肽调节剂具有更好的选择性和特异性。细胞内小分子多肽钾通道•治疗自身免疫性疾病的新靶标：Kv1.3通道•靶向Kv1.3通道的先导药物研发•靶向Kv1.3先导药物在预防和治疗自身免疫疾病中的应用靶向钾通道Kv1.3的药物研发疾病动物模型治疗药物药物类型药物有效剂量类风湿性关节炎大鼠PIA模型SL5多肽100ug/kgI-型糖尿病MHCII限制型DP-BB/W大鼠模型PAP-1小分子50mg/kg过敏性皮炎大鼠ACD模型PAP-1/ShK小分子/多肽10mg/kg/16ug/kg多发性硬化症实验性自身免疫脑脊髓炎大鼠模型ShK，ShK-Dap32多肽16ug-80ug/kg先导药物在预防和治疗自身免疫疾病中的应用靶向Kv1.3通道治疗多发性硬化症靶向Kv1.3通道治疗I-型糖尿病靶向Kv1.3通道治疗类风湿性关节炎靶向Kv1.3通道治疗多发性硬化症临床病例证实多发性硬化症（MS）病人中经髓鞘质抗原激活的T细胞为特异性表达高数量Kv1.3通道的表型。MS病人中激活的TEM细胞显著增加，其中TEM细胞高表达Kv1.3通道。CD8+的效应记忆T细胞激活后也高表达Kv1.3钾通道Kv1.3通道的阻断剂多肽ShK可选择性抑制MBP特异性的TEM细胞增殖Kv1.3通道阻断剂多肽KTX抑制MBP诱导的T细胞增殖和激活MS病人的脑组织炎症细胞中特异性高表达Kv1.3通道MS病人脑脊液细胞（CSF）在体外激活后，迅速转变为TEM细胞；