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h1第八讲农药生物测定与田间药效试验主要内容：1、农药的生物测定2、农药田间药效试验h2一、农药的生物测定1、概述•农药的生物测定：是指利用生物（动物、植物、微生物等）的整体或离体组织、细胞以及细胞中的活性物质（如靶标酶、细胞膜等）对某些化合物的反应如死亡率、抑制率等，作为评价他们生物活性的量度，运用特定的实验设计，以生物统计为工具，测定供试对象在一定条件下的效应。•生物测定涉及的内容和范围：•（1）活性筛选的常规测定；•（2）农药残留的微量生物分析；•（3）抗性毒力测定；•（4）药害毒性测定。h32、生物测定试验设计的基本原则基本要求：•室内测定的药品应该是纯品，至少要有确切的有效成分含量；•供试生物应该是纯种，个体差异小，生理标准较为均一；•确定的环境条件。h4（1）相对的控制环境条件•室内应该尽量保持与田间环境条件的一致性；•测定农药的毒力，原则上要求只有两个变数，一个是药剂的剂量或浓度作为自变数，另一个是死亡率或抑制率作应变数；•室内测定：要控制温度和湿度；使用精密的测试仪器及严格的测试方法；供试虫种或菌种要用室内饲养标准化的纯种；•小区试验：应尽量力求所选地区土壤肥力、病虫害分布、作物长势及管理水平等条件均匀相似。h5（2）必须设立对照•空白对照：不做任何处理的对照；•不含药剂对照：与药剂处理所用溶剂或乳化剂完全一样，只是不含药剂；•标准药剂对照：用标准药剂作对照。（3）处理必须设重复•一般至少重复3次。（4）运用生物统计分析试验结果h63、供试材料•应参考的原则：•在室内人为环境条件下，应用较简便、快速的繁殖技术，可保证全年定时大量供应，不受季节限制；•应是广泛发生为害的主要农林有害生物，具有重要的经济意义，而且在分类地位上有一定的代表性；•对药剂的敏感性符合要求，试验时易操作。h7•我国常用的生物种类：（1）昆虫和螨类•粘虫、棉铃虫、玉米螟、二化螟、小菜蛾、褐飞虱、棉蚜、豆蚜、米象、杂拟谷盗、家蝇、淡色库蚊、朱砂叶螨等。（2）病原菌•稻瘟病菌、水稻纹枯病、小麦条锈病菌、甘薯黑疤病菌、黄瓜霜霉病菌、柑桔青霉病菌等。杂草•野燕麦、稗草、看麦娘、苋、荠菜、播娘蒿、藜等。h84、室内毒力测定的方法（1）杀虫剂的毒力测定•杀虫剂的毒力测定方法要根据作用方式来设计。•A、常规活体生物测定•a.触杀作用•喷雾法如Potter喷雾塔•喷粉法适用于水生昆虫、储粮害虫、介壳虫及蚜虫、供试昆虫的卵等。•浸液法•点滴法一般用冷冻法、乙醚处理法、二氧化碳处理法将试虫麻醉。•注射法•药膜法将定量的药剂均施于滤纸、玻璃板或蜡纸上，形成一个均匀的药膜，再将供试昆虫放在上面爬行一定的时间，然后再转移到正常的环境下，一定时间后观察记录昆虫死亡情况。适用于一切爬行的昆虫和某些飞翔的昆虫（如蚊、蝇等成虫）。h9b.胃毒作用①饲喂法：饲喂的方法分为无限制给食法及定量给食法；根据饲喂的方式又分为叶片夹毒法及单叶饲喂法。•叶片夹毒法：吞食药量的计算是以试虫吞食叶面积乘以单位面积叶片的剂量（μg/g）。•叶面积计算：方格纸法、叶面积测定仪法、电脑扫描法。•致死中量的求法：按每头虫吞食剂量的大小顺序排列，并标明该剂量下试虫的死活情况，从而将虫划分成生存组、生死组和死亡组。生死组中既有生存的又有死亡的，分别计算生死组中生存个体和死亡个体平均吞食的药量，记为A和B。•A=（生死组活虫剂量总和）/生死组活虫总数•B=（生死组死虫剂量总和）/生死组死虫总数•LD50=（A+B）/2h10②饲饮法此法适用于蝇、蝽类等有吸食习性的昆虫。•又分为自由饲饮法和强制饲饮法•自由饲饮法：是一种无限制的饲饮方法，让昆虫自己取食配好的混有药剂的糖液，通过测定吸食前后昆虫的重量或药液的体积计算昆虫吸食药剂的量；•强制饲饮法：是将昆虫固定后，将装有药液的移液管口放在昆虫的口边，昆虫吸食到一定的体积后就移开移液管，保证每头虫体吸取药剂的量相同。c.熏蒸作用•要求：必须在密闭的条件下进行。•仪器装置：有静止气体的测定装置和有气流出入控制的熏蒸器。h11d.内吸作用•直接测定法：•间接测定法：用药液处理植物的局部，一定时间后取未处理的部位加以研磨，稀释成不同浓度的汁液，再放入一定数量的水蚤等观察其死亡情况，利用此法间接测定药剂是否有内吸作用。e.拒食作用•以昆虫的取食量或昆虫对食物的所食部位和昆虫体重的变化等做的分析，作为药剂对供试昆虫是否有拒食活性的依据。•选择性拒食活性测定：在同一培养皿中交错放入处理叶碟与对照叶碟的方法；•非选择拒食活性测定：在培养皿中仅放入对照或处理叶碟的方法。h12f.引诱作用•分性引诱剂、食物引诱剂和产卵引诱剂。g.驱避作用•其原理与引诱作用相类似。h.生长发育与生育干扰作用•通过胃毒、接触、熏蒸、内吸等处理方法，观察昆虫蜕皮、化蛹、羽化的变化及其形态的变化、产卵量及卵的孵化率等指标来观察药剂作用的效果。h13B.细胞水平及分子水平的生物测定a.预期作用靶标抑制活性的测定•可以简化生物筛选测定的步骤与时间。b.MTT（四噻唑蓝）法•活细胞中的琥珀酸脱氢酶可使MTT分解产生紫色结晶状颗粒积于细胞内和细胞周围，其量与细胞数及细胞活力呈正比。药剂处理细胞后，加入MTT，再测出所有混合液体的吸光值，可推断细胞的活力，衡量供试药剂的毒力大小。c.生物传感器是一种以生物的部分活性物质作为敏感部件，结合物理化学分析仪器，对特定种类化学物质或生物活性物质具有选择性和可反应的分析装置。•按照识别元件可分为：基于分子（酶、抗原或抗体、受体、核酸、脂质体等）的传感器、基于细胞的传感器和基于组织切片的传感器。h14d.生物芯片•生物芯片技术，采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子，如核酸片段、多肽分子等生物样品有序地固化于支持物（如玻片、硅片等）的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器，如激光共聚焦扫描等对杂交信号的强度进行高效、快速地检测分析，从而判断样品中靶标分子数量。h15C.高通量筛选a.活体筛选•只对个体较小、对药剂敏感而且容易培养和操作的供试昆虫，如鳞翅目低龄幼虫、水蚤等较为适用；•操作步骤：将一定量的待测药液和昆虫人工饲料或营养液分别加入微量滴定板的孔中，混匀；然后将单头供试昆虫或者卵置于每一孔内，用透明盖封好，放置在温度、湿度、光照等适宜的控制条件下培养一定时间，后检查结果，观察记录供试昆虫的生命指标，如生存或死亡、生长取食情况等，推测判断供试药剂的生物活性。b.离体筛选•受体结合试验：适用筛选对供试昆虫神经受体有抑制活性的化合物；•靶标酶活性测定：用于筛选对昆虫靶标酶有活性的化合物。h16（2）杀螨剂的毒力测定A、玻片浸渍法B、叶片残毒法•是在培养皿中放入已经用药液处理并晾干的叶片，然后接入长势一致的成螨，放入培养箱，一定时间后观察其死亡率。C、叶碟浸渍法•是将带有成螨的叶片直接浸渍在药液中5s后取出，一段时间后，观察螨的死亡率。h17（3）杀菌剂的毒力测定方法A.基于离体平板培养的毒力测定方法a、孢子萌发测定法•其原理是在载玻片或平板上，通过滴加或喷施等方法将药液施于其上，然后滴加一定浓度的孢子悬浮液，经过一定时间培育后，在显微镜下观察孢子的萌发率。b、抑菌圈法•先将病原菌孢子或菌丝的悬浮液与培养基混匀，待混合物冷却后，放入吸有不同浓度药液的纸片（或圆环中加药液），经过一定时间培育后，观察以纸片为圆心的抑菌圈的大小。h18c、生长速率测定法•是趁热在培养基中加入药液，混合均匀后冷却，然后在无菌条件下将病原菌接入装有培养基的培养皿中央，经过一定时间培育后，观察病原菌菌丝的生长情况。d、对峙培养法•是将天然提取物及病原菌同时放在同一有培养基的培养皿的两边，经过一定时间培育后，观察菌丝生长的情况。如果提取物有抑菌作用，则病原菌的生长会受到一定的限制。h19e、高通量筛选方法（a）活体筛选方法•以各种病原物为筛选靶标的直接筛选方法：首先将一定浓度样品用移液器移至微量滴定板上，再用另一移液器将均匀的供试菌菌丝体或孢子悬浮液接种到每一孔上，混匀后用分光光度计测定混合液的初始光密谋值Ⅰ，然后置适宜条件下振荡培养一定时间，再测定光密度值Ⅱ，如果二者相等或光密度值Ⅱ降低，说明菌体不能生长，判定被测物有活性，否则无活性。•以酿酒酵母菌为模型菌的筛选方法：在控制条件下，将酿酒酵母菌与待测化合物相互作用一定时间后，观察化合物对酵母菌生长的抑制情况。（b）离体筛选方法•靶标酶的测定方法：如将菌体悬浮液与牛心线粒体及待测化合物分别加入微量滴定板孔中，混匀，控制条件下反应一定时间后，在340nm下测定光密度值，计算NADH的含量，如果NADH含量降低，说明待测物抑制了电子传递过程，化合物有活性。•全细胞测试：用于筛选真菌甾醇生物合成抑制剂。h20（2）组织筛选测定法•介于活体与离之间的筛选方法；•测定药剂的保护作用：取小块寄主植物的主要寄生部位经过供试药剂处理后，再接种病原菌，通过一段时间的培养后，观察药剂是否对病原菌有防治效果；如测药剂是否有治疗作用，则先接种病原菌，然后再将药液处理植物组织。h21（4）除草剂的毒力测定方法（1）对种子萌发的测定方法A、培养皿法•药剂处理种子后培育一段时间，观察敏感植物根长抑制率或芽长抑制率。B、黄瓜幼苗形态法•是每隔一定时间观察黄瓜幼苗的形态，与事先已经用2,4-D系列浓度处理后的黄瓜幼苗形态作对照的标准图谱进行对比，推测药剂活性的大小。C、琼脂测定法•是将药剂定量的倒入融化的琼脂液中，混匀后倒入培养皿中冷却凝固，之后接入供试植物的种子，观察发芽后的情况。h22B.植株生长量的测定方法•主要针对已经发芽的除草剂，尤其是抑制光合作用的除草剂的常规室内生物测定方法。a、去胚乳小麦幼苗法•此法是测定抑制光合作用除草剂的专用方法；•先挑选出长势一致的幼苗，摘除胚乳后，用供试药液处理幼苗，培育一定的时间，测定幼苗的株高，以株高抑制率来衡量药剂的活性。b、萝卜子叶法•此法适用测定触杀性及影响氮代谢的除草剂；•先将萝卜籽催芽成幼苗后切下子叶，并用不同浓度的供试药液处理子叶，保持恒温，并在一定的光强下培养一段时间，称量鲜重及测定叶绿素的含量，计算IC50。h23C.生理指标的测定方法a、浮萍法•基本原理是季胺盐类除草剂可以干扰植物细胞光合作用中的电子传导系统，使植物失水失绿枯死；•将药剂配成一定的浓度后，利用水中浮萍的失绿程度可以作为评判药剂活性的指标；•用乙醇提取被处理的浮萍中的叶绿素，以叶绿素的含量作为评判指标。b、单细胞藻类法•此法对抑制光合作用和呼吸作用的除草剂特别灵敏；•一般选用小球藻作为指示植物，将供试药液跟有小球藻的培养液混匀后，恒温培养一段时间，甲醇提取叶绿素，用分光光度计测定叶绿素的透光率，推算出药剂的EC50。h24c.希尔反应法•基本原理是叶绿体在光照条件下，使水光解产生H+和电子，同时放出氧气，产生的电子使电子受体（氧化剂）还原，可筛选光合作用抑制剂；•如铁氰化钾，在光下可以发生从水中释放氧气的反应，同时氧化剂被还原变色，利用这一反应，用分光光度计对底物Fe(CN)63-的减少量或产物Fe(CN)64-及O2的形成量进行测定，就可以定量测定希尔反应活力，判定药剂的活性。d、酶水平测定方法•如通过测定植物体内莽草酸的累积量，作为评价草甘膦活性的衡量指标；•根据磺酰脲类除草剂可抑制乙酰乳酸合成酶ALS活性的原理，可用乙酰乳酸合成酶活性的变化测定植物对磺酰脲类除草剂的活性。h25D.高通量筛选a.活体筛选•代表性植物为测试对象：一般用藻类、浮萍等水生植物作为供试生物，在微量滴定板孔中加入药液，一定时间后测定混合液的光密度值变化。•种子处理生长测定法：一般选取的供试植物种子个体比较小，如小米、鼠耳芥、剪股颖等，在微量滴定板孔中加入待测药液，然后加入植物种子以及营养液，培养一定时间后，观察种子萌芽及生长发育情况。h26b.离体筛选•对靶标酶抑制活性的测定方法：植物体内生物物质合成及能量代谢的关键酶是供试药剂起抑制作用的靶标酶。如测定无机磷酸（Pi）的变化，可以评价对乙酰辅酶A羧化酶、谷氨酰胺合