第二章-海洋生物样品的采集与活性筛选方法

第二章海洋生物样品的采集与活性筛选方法2相对与陆地生物样品，海洋生物样品采集和保存更加困难。海洋样品采集困难海洋样品活性成分含量少，药物分析需求量较大。样品保存要求较高3一、海洋生物样品的采集方法1.潜水采集：（采样深度~数十米）样品主要为海绵、珊瑚、海藻、海星和贝类等。4必须由经过科研潜水培训且具有生物学知识的潜水员或实践经验丰富的渔民来完成。一个大气压人工操作潜水器的应用使采集者可以深入水下1000米采集20世纪90年代，出现遥控潜水装置（非人工）5采样步骤1–准备采集网具采样步骤2–采集水桶、福尔马林、洗涤瓶与采样瓶2.捕捞、拖网采集：海洋鱼类、浮游生物等。雇佣专门的海洋考察船：大量采集某一特定海洋生物样品随渔民拖网作业：未设定明确的目标样品，研究者需随船对捕获物进行辨识、捡拾，获得所需样品。搭乘远洋渔船：仅以收集多种海洋生物样本进行活性筛选为目的6采样步骤3–进行拖网采集作业采样步骤4将可能附着的浮游动物冲至网底7采样步骤5将网里附着的浮游动物冲至网底采样步骤6将拖网缝隙里的浮游动物冲至网底83.深海潜水器采集：海洋生物密集地、岩石的斜坡、深海底部或峭壁等目前最深可潜到5000米94.其他采集方式潮间带或者滩涂的生物一般采用捡拾、挖掘，岸边还可以进行手抛网采集，而一些海洋样品亦可以从当地市场买得。10二、采集样品的具体要求（一）采样工具及试剂1、采样工具铁锹：掘取栖息在泥沙中的动物铁钩子或小铁铲：采集栖息在浅层泥沙中的贝类凿子：凿取栖息在岩石或岩石缝隙内的动物，如牡蛎等冰瓶：保存样品组织捣碎机：制作样品匀浆解剖用不锈钢刀、各类型镊子及剪刀；医用酒精棉球；一次性塑料袋、乳胶手套；广口瓶、聚乙烯袋、纱布、卡尺、记录本、记号笔等。如进行潜水采集，需配备全套潜水器具112、常用试剂70%乙醇溶液取市售的95%乙醇溶液70ml，加25ml蒸馏水，用于贮存样品5%甲醛溶液取市售的40%甲醛水溶液12.5ml，加入95ml蒸馏水或海水，用于制作和保存标本碘液2g碘化钾+1g碘溶于200ml蒸馏水12（二）采样方式采集样品时尽量保持生物个体不受损伤。栖息在岩石或其它附着物上的个体，要用凿子凿取；栖息在沙底或泥底的生物个体可用铲子铲取或铁钩子扒取。贝类样品的采集挑选体长大致相似的个体，若壳上有附着物需去除，彼此相连的个体应分开，现场用海水冲洗干净后，放入双层聚乙烯袋中冷冻保存。藻类样品的采集采集大型藻类样品后用现场海水冲洗干净，放入双层聚乙烯袋中冷冻保存或现场摊晾、晒干后包装。13海洋微生物的采集采自海洋底泥、海水、海洋动植物等→从泥样和水样中分离微生物，从海洋动植物分离附生菌（生物的表面）、内生菌（生物的体内组织）等共生微生物。采集的样品最好立即或尽快进行目的菌的分离，如无条件，则需将样品暂存于4～8℃的低温环境中。分离过程与环境的要求：无菌一般分离过程:将采集的材料接种到分离介质中培养，然后将生长出的菌落在显微镜下转移到其它培养基中，直至分离到单一菌株。最后选择合适的培养基放大培养。？许多海洋生物体内的共生菌难以在体外培养。14海洋活体样品的采集某些海洋生物仅需研究其分泌物或毒液，采集时应尽量保证能捕捉到活的生物个体，并采用与其栖息环境相似的条件饲养。也可在现场即刻采取毒液等样品，如芋螺毒液的收集。15三、样品的处置和保存161、样品的编号、采集、记录根据采集样品的安排，对采集后分拣的不同样品进行编号。编号后的样品应选择形状、色泽好的进行拍照。记录样品的一些初步特征。采集原料信息的记录：地理位置、生物的性别和生长阶段等。留出适当的样品作为今后种类鉴定用。172、生物种类鉴定采集的样品必须确定种属：比对照片、图谱海洋生物分类学专家鉴定样品应留存标本，并注明样品的来源信息。18大量样品的处理上岸之前进行冷藏处理。上岸后根据样品的情况进行分别处理。绝大多数样品可以进行冷冻处理。不稳定的化合物---特殊处理：冷冻保存、冷冻干燥（干冰贮器或液氮罐，如柳珊瑚中提取前列腺素；保温桶或泡沫塑料箱放入冰块；）少量样品：密封的聚乙烯袋，与样品标签一起放入另一聚乙烯袋或洁净广口瓶，封口，冷冻保存。3、样品用自来水冲洗水冲洗是为了减少样品的无机盐和附着的浮游生物等。曾有报道：从样品中分离的化合物有些其实是共生或附生的生物含有对于成分未知或含肽类易变活性成分的样品19上岸后根据样品的情况进行分别处理。无条件者可用有机溶剂（95％乙醇）浸泡，之后密封入塑料袋或桶中。运回实验室可直接提取活性成分。但对多肽等遇有机溶剂变性的样品不适合。海藻等可以晒干或者晾干保存：会损失部分有效成分，采集量要大。活体饲养：采集后应营造与生物个体生存环境相近的条件进行饲养，并尽早运回实验室。204、样品的实验室处理☺采集到的大量样品浸泡于酒精中，如果时间允许，应尽快提取进行成分分析。☺样品浸泡时间不宜过长，防止样品中的化学物质发生变化。☺样品储存应该尽量保持低温，防止样品腐烂。海藻等样品也要注意防虫、防腐、防霉等处理。夏威夷大学在研究箱鱼毒素时，曾采用巧妙的方法，箱鱼捕捉后立即放入已经准备好的蒸馏水中，由于环境发生变化箱鱼排出毒素，然后将含毒素的蒸馏水用丁醇提取浓缩后经纯化得到。21四、样品的活性筛选（一）活性筛选发展的三个阶段1、有目的地寻找某类已知的活性化合物及其类似物——测定不同生物中感兴趣的化合物的含量；活性测定方法仅作为研究手段。2、寻找具有某种生物活性的物质，一般是未知物——采用某一筛选模型对大量样品进行广泛筛选，在确定样品具有活性后再开展深入研究。目前多数研究处于这一阶段3、高通量（HTS）筛选——采用多种药理模型，在分子、受体水平上对大量样品进行快速、高效、低成本的活性筛选。22根据所选材料、药物作用对象以及操作特点的不同，可以将活性筛选模型分为三类：整体动物水平模型与传统筛选程序理想的动物模型应具备的基本条件：病理机制与人类疾病的相似性、病理表现的稳定性和药物作用的可观察性。优点：可从整体水平直观地反映药物的治疗作用、不良反应以及毒性作用。临床试验不可或缺的前提。缺点：依赖手工操作、样品量大、病理模型太少。局限性、低效率、高成本（二）活性筛选模型的分类23组织器官水平模型和体外药物筛选方法优点：通过观察活性成分对特定组织或器官的作用，可以有效地观察药物的作用原理和可能具有的药理作用——降低筛选样品的用量和动物用量；提高筛选效率，降低筛选成本；减少了影响药物作用的因素，易于评价药物作用。缺点：规模小、效率低、反映药物作用有限、样品需要量大、不易实现一药多筛、人工操作技术要求高。离体血管实验，心脏灌流实验、组织培养实验等24细胞、分子水平模型和高通量药物筛选以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行试验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验结果数据，以计算机对实验数据进行分析处理，同一时间对数以千万样品检测，并以相应的数据库支持整个体系运转的技术体系。优点：材料用量少、作用机制比较明显、可大规模进行筛选，效率高。缺点：离体实验，可能造成假相。25有机相提取体系海洋生物原料+有机溶剂→浸提→过滤或离心→减压浓缩→浓缩液→有机溶剂→二次提取→喷雾干燥→粗品水相↓粗品干燥回收溶剂轻相液液萃取喷雾干燥←液膜浓缩重相柱层析体系——纯化海洋生物原料→浸提→过滤或离心→减压浓缩→浓缩液→溶解→微孔过滤超滤→柱层析→分部收集组分→浓缩→冷冻干燥→目标成分水相提取体系海洋生物原料+水→浸提→过滤或离心→减压浓缩→浓缩液→喷雾干燥→粗品└→液液萃取→有机相粗品←喷雾干燥←浓缩←水相（三）样品处理和活性筛选流程2627海洋微生物活性物质的筛选与研究流程28（四）常用的活性筛选方法生物活性的筛选方法各式各样，筛选效率直接与实验的设计有关，靶标越明确，越有可能获得特定活性的产物，因此如果对病理和药理方面有越深入越具体的了解，就越有利于筛选。常用的活性筛选方法包括以下几种：291.抗菌活性筛选---抗生素的研究抗菌活性筛选是目前应用非常广泛的活性筛选方法之一，特别在药用微生物和抗生素的筛选上，本方法起到了举足轻重的作用。抗菌活性主要包括抗细菌、抗真菌、抗支原体活性的筛选。30据世界卫生组织（WHO）规定的标准方法，即Bauer-Kirby纸片法进行药效测定。初筛菌株包括：金黄色葡萄球菌（G＋）、藤黄八迭球菌（G＋）、大肠杆菌（G－）、绿脓杆菌(G－)等。深入研究的试验菌株有以上细菌的耐药株和临床株。（1）抗一般细菌药物筛选31厌氧菌（Anaerobic）是一类对游离氧敏感的微生物，生长需要一定的厌氧环境，目前对抗厌氧菌药物筛选尚无一种公认的标准方法。微量液体稀释法(BrothMicro-DilutionMethod)：筛选抗变形链球菌（龋齿的主要病原菌）药物；琼脂稀释法(AgarDilutionMethod)：筛选抗幽门螺杆菌（胃及十二指肠溃疡的致病菌）药物。(2)抗厌氧细菌药物筛选可在一个平板上同时作多株菌MIC测定微量液体稀释法：培养基：Mueller-HintonBroth(组成肉浸膏300g/柠檬酸17.5g/淀粉1.5g/蒸馏水1000ml），灭菌后，25℃水浴中调节pH7.1-7.4,在配制好的培养基中加入Ca2+和Mg2+各25mg/L;操作：选择U字形微量板进行试验，每孔中加入约0.1ml含样品的上述培养基，用专用盖密封后，在-60℃下保存，有效期可以维持3个月左右，抗菌药物的溶解与稀释需用蒸馏水和上述培养基；接种菌量最终达到每孔104cuf;一般在5±1℃的条件下培养18-24小时；结果判定：确认用于对照的未添加药物的培养基中有细菌生长后，将肉眼观察到没有细菌生长的培养孔中的药物浓度定为MIC。32真菌是高级进化的微生物，种类多，生长发育过程复杂，其菌体可分化成菌丝型和酵母型，对药物的敏感性不同。在新药筛选时，除用纸片法或琼脂稀释法测定药效、测量抑菌圈范围外，还要仔细观察被测物质是否阻止分生孢子萌发，抑制菌丝生长扩散，或造成菌丝畸形等。初筛真菌有：白色假丝酵母（酵母型）和红色毛癣菌（菌丝型）。(3)抗真菌药物筛选常用33支原体（Mycoplasma）是界于病毒和细菌之间没有细胞壁的微生物，广泛分布于自然界，能引起人类和动植物的感染以及各种组织细胞培养的污染。支原体能在特殊的培养条件下生长繁殖，引起pH值变化，故采用颜色改变单位（ColorChangeUnit,CCU）检定其生长状况。当被测物质发挥生长抑制效应或杀灭支原体时，含有指示剂的培养基不再变色，据此判断药效。初筛的试验菌株有溶脲支原体（人体致病菌，细胞株污染）和人型支原体（人体常见株，条件致病，细胞株污染）。(4)抗支原体药物筛选342.对动物影响活性的模型环节动物、鲍鱼以及咸水虾的幼体可用于检测样品对动物的毒性或其他影响。通常多个幼体置于样品液中，然后观察对致死性或对变态过程、定殖效果、虫室形成等方面的影响。（1）对动物幼体的定殖或变态的抑制35（2）对无脊椎动物运动的影响：在加有样品的溶液中，如果一个饲养着的水螅或者其他动物总保持收缩状态，可以认为遇到有毒的代谢物。（3）金鱼毒性试验：样品对小金鱼的影响，可表现为致死或者失去平衡等。（4）通过器官和生理系统检测：可检测心脏、血压和肌肉等的作用活性。36海虾卵的孵化：取海虾卵100mg置于500mL烧杯中，加入人工海水400mL，用一小充气泵缓缓充气，室温孵化24小时，除去卵壳及未孵化的卵，海虾幼虫继续培养24小时，备用。海虾生物致死法：取96孔细胞培养板，每孔加100µL，含10-15个海虾幼虫的人工海水液，制成测试培养板。空白对照组和每个浓度的样品组各设三个平行孔，空白对照组加100µL人工海水，样品组加100µL所需浓度的样品液。测试样品设置终浓度为50µg/mL。室温培养24小时后，在双目解剖镜下检测计数海虾死亡个体数目。海虾死亡率＝[(原始数目-存活数目)/原始数目]×100％举例：海虾生物致