gb17013-1997

【GB17013—1997】包虫病诊断标准及处理原则前言包虫病又称棘球蚴病，是棘球绦虫的幼虫寄生在人体内引起的疾病。在我国有两种，即细粒棘球蚴引起的囊型包虫病和由多房棘球蚴引起的泡型包虫病。我国已有22个省（市）、自治区存在当地感染的囊型包虫病人。泡型包虫病在宁夏、新疆、甘肃、四川、青海、西藏和黑龙江有病例报告。包虫病是我国北方和西南地区危害人畜的重要寄生虫病，属法定丙类传染病。本标准由中华人民共和国卫生部提出。本标准负责起草单位：卫生部包虫病防治培训基地（新疆地方病防治研究所）；参加起草单位：新疆维吾尔自治区人民医院、中国预防医学科学院寄生虫病研究所。本标准主要起草人：柴君杰、谭家忠、薛海筹。本标准由中华人民共和国卫生部委托技术归口单位中国预防医学科学院负责解释。1范围本标准规定了囊型包虫病和泡型包虫病的诊断及处理原则。适用于各级、各类医疗保健、卫生防疫和地方病防治机构对两型包虫病的诊断和处理。2定义2．1囊型包虫病cystichydatiddisease（CHD），cysticechinococcosis（CE）由于细粒棘球绦虫（Echinococcusgranulosus）的幼虫寄生而引起的疾病。2．2泡型包虫病alveolarhydatiddisease（AHD），alveolarechinococcosis（AE）由于多房棘球绦虫（Echinococcusmultilocularis）的幼虫寄生而引起的疾病。3诊断标准3．1流行病学史流行地区的居住史或旅游史，豢养或接触过家犬。有野外工作和猎狐史；接触过狐狸尸体、皮张等。3．2临床表现3．2．1囊型包虫病：早期可无任何症状，往往在影象检查中发现。肝囊型包虫病有肝区隐痛、上腹饱胀感、消化不良、消瘦、贫血。肝大，上腹部包块。肺囊型包虫病有胸部隐痛、刺痛、胸闷、咳嗽、气短、咯血，有时随痰咳出粉皮样内囊碎片或子囊，或在痰液检查时发现原头节的头钩。其他脏器包虫病具有该脏器占位性疾病之特有症状。3．2．2泡型包虫病：肝大、肝区隐痛。晚期肝功能损害，脾肿大、肝脏可触及硬结节、黄疸，消瘦、衰竭。发生转移时出现转移病灶所在脏器产生的症状。3．3影象检查影象学特征在包虫病的诊断上有重大价值。肝包虫病以B超扫描为主要手段，肺包虫病以X线检查为主，各有特征性影象。为了鉴别诊断或有特殊需要时，可做CT检查（详见附录B）。3．4实验室检查（详见附录A）3．4．1检测血清中特异性抗体（用IHA、ELISA、EITB等方法）。3．4．2检测血清中特异性循环抗原或免疫复合物。3．4．3痰液和咳出物的寄生虫学检查。3．4．4临床标本的病理组织学检查。3．5临床诊断具备流行病学史、主要临床症状或体征、影象学特征或血清中检出特异性抗体者。3．6确定诊断除具备临床诊断的依据外，还具有下列条件之一者。3．6．1血清中反复检出特异性循环抗原或免疫复合物。3．6．2咳出囊膜、子囊或痰中检出头钩。3．6．3临床活检材料病理组织学检查证实。3．6．4手术探查证实为包虫囊。4处理原则4．1手术治疗4．1．1囊型包虫病手术方式4．1．1．1内囊穿刺摘除。4．1．1．2内囊完整摘除。4．1．1．3包虫完全切除（肝叶切除）。4．1．1．4肝、肺外囊残腔的合理处理。4．1·2泡型包虫病手术方式4．1．2．1根治性切除。4．1．2．2姑息性切除。4．1．2．3姑息性清除引流。4．2药物治疗4．2．1药物和疗程阿苯达唑为首选药物，以采用小剂量（10mg／kg）长疗程或多疗程反复治疗的方法较好。泡型包虫病人应以药物治疗为主。对于晚期病人疗程可达3～5年，甚至终生维持治疗。4．2．2适应证4．2．2．1囊型包虫病。4．2．2．1.1继发性腹腔、胸腔包虫病。4．2．2．1．2多脏器、多发囊或多次手术后复发的包虫病人。4．2．2．1．3早期发现的包虫病人。4．2．2．1．4不宜手术或拒绝手术者。4．2．2．2泡型包虫病：不论手术与否均应进行药物治疗，包括晚期病人，肺、脑转移者。4．2．2．3手术前后病人进行2～3个疗程有控制术中原头节移植和防止复发的作用。4．2．3禁忌证肝、肾功能不全和孕妇禁用。5预防5．1实行家犬管理和吡喹酮驱虫。5．2开展预防包虫病的健康教育。5．3严格实行屠宰管理，妥善处理感染牲畜的脏器。5．4在泡型包虫病高发区开展控制狐狸传播本病的措施。5．5在高流行区人群中进行普查、早期发现病人给予治疗。附录A（标准的附录）免疫学诊断方法A1间接红细胞凝集试验（IHA）A1．1抗原制备用2．5％戊二醛醛化的绵羊红细胞，经终浓度120000∶鞣酸处理后，以最适浓度的囊液粗抗原或纯化的抗原致敏。致敏后的红细胞以含10％蔗糖及1％正常兔血清的pH7．2PBS配成5％悬液分装安瓿（1mL／支），置4℃冰箱保存或冻干封存（0．2mL／支）。使用浓度为1％。A1．2操作方法A1.2．1准备抗原：如为冻干产品，则加入1mL蒸馏水稀释混匀备用。A1．2．2用微量滴管滴加1％兔血清－磷酸缓冲盐水于V型微量反应板上第一孔加3滴，其余各孔均为1滴（25μL）；至少做六孔。第一孔加待检血清1滴（25μL）即血清稀释度为14∶；混匀后从中吸取血清1滴加入第二孔；混匀，依次作倍比稀释；最后一孔混匀后吸弃1滴。并平行做阴性、阳性对照。A1．2．3从第二孔起，每孔加入致敏红细胞悬液1滴（25μL）；立即振摇1min；加盖板，室温下静置1h，观察结果。A1．3结果判断A1．3．1阴性反应：红细胞全部沉入孔底呈点状，边缘光滑。A1．3．2阳性反应：以血清1128∶稀释出现阳性反应者（++或+++）判为包虫血清抗体阳性。+++红细胞形成薄层凝集，充满整个孔底或边缘有皱褶。++红细胞形成薄层凝集，面积较小，边缘松散。+红细胞大部分沉于孔底，形成一圆点或圆圈，周边模糊或中心有白色小点。A2酶联免疫吸附试验（ELISA）A2．1抗原包虫囊液纯化抗原（磷钨酸、氯化镁沉淀法制备）。A2．2操作方法A2．2．1抗原包被聚苯乙烯板：用0．05mo1／LpH9．6碳酸缓冲液稀释抗原至最适浓度，每凹孔加入100μL，置温盒。4℃过夜（或12～24h），次日，倾去抗原，用含0．05％吐温20磷酸缓冲盐水（0．01mol／L，pH7．4PBS－T）洗涤3次，每次5min，甩干。A2．2．2加待检血清：血清用PBST作1200∶稀释，每凹孔加入100μL，每板应设参考阳性一孔，参考阴性三孔及PBS对照一孔。置温盒，371h℃，然后取出，倾去血清，洗涤同前。A2．2．3加结合物：加入用PBS－T作工作稀释度的辣根过氧化物酶（HRP）－标记结合物100μL，37℃，1h倾去结合物，洗涤同前。A2．2．4加底物：通常加邻苯二胺（OPD）底物溶液（10mgOPD＋25mLpH5．0柠檬酸缓冲液＋30％H2O210μL）100μL，37℃，30min。A2．2．5加中止液：2mol／LH2SO450μL。A2．3结果判断在酶标专用比色计上读取492nmOD值，以待测样本（S）对阴性对照血清（N）的S／N值≥2．1为阳性临界值。A3PVC薄膜快速ELISAA3．1抗原包虫囊液纯化抗原。A3．2操作方法A3．2．1取已包被好抗原的PVC薄膜软板，编号，用PBS-T洗一次，然后每孔加PBS－T200μL；A3．2．2加待检血清及参考血清（每板作阴性对照一孔、阳性对照一孔）每凹孔10μL，混匀，置湿盒375min℃（或25℃室温10min）。倾去血清，用PBS－T连续洗8次，甩干。A3．2．3加酶结合物：按工作浓度稀释，每孔200μL，375min℃，倾去结合物，同上洗涤8次，再加蒸馏水洗一次，甩干。A3．2．4加入底物溶液：含3％H2O2的TMB底物，每凹孔200μL，反应5～10min（TMB底物溶液的制备：TMB50mg溶于10mL二甲基亚砜中作为母液，4℃保存。用前取母液1mL＋pH5．0柠檬酸缓冲液50mL＋30％H2O28μL）。A3．3结果判断按每批的阴性及阳性对照目视判断结果。阴性基本无色，阳性为鲜蓝色。A4酶联免疫印渍技术（EITB）A4．1抗原膜条制备采用5％～20％厚0．75mm梯度胶，包虫囊液抗原按1μg／mm加入，上槽缓冲液为0．1mol／L硼酸缓冲液，下槽液为0．424mol／LpH9．18Tris／HCl，抗原经SDS－PAGE电泳分离后，再经转移电泳。转移电泳液为0．212mol／LpH9．18Tris／HCL，含20％甲醇电泳30min，即将分离的抗原蛋白带由凝胶转移到硝酸纤维膜上，此膜用PBS－T洗3次，PBS洗1次，每次5min，然后将膜切成3mm宽的长条，此为抗原膜条，夹于PBS湿滤纸中封于塑料袋，保存于冰箱中备用，若存于低温冰箱，可长期保存。A4．2操作方法A4．2．1试验时，将膜取出或解冻。先于反应槽中加入495μL含5％脱脂奶粉及3％吐温PBS，再加入5μL待检血清，最后加入抗原膜条，每批试验应设参考阳性、阴性和PBS对照。室温振摇1h（4℃可过夜）。次日，用0．3％吐温－PBS洗4次，每次5min吸干。A4．2．2加入工作浓度稀释的结合物，室温1h，洗涤同前。A4．2．3加入DAB－H2O2系统（25mg3，3′－二氨基联苯胺＋50mL无吐温PBS＋5μLH2O2）显色10min，自来水冲洗中止反应，晾干。A4．2．4判读结果：目测特异性条带，以60KD、36KD、32KD、24KD、20KD、17KD和12KD为阳性条带。其中只要出现12KD、17KD、24KD条带即可判为阳性。A5循环抗原检测A5．1将抗包虫单克隆抗体用0．05mol／LpH9．6碳酸盐缓冲液稀释至工作浓度包被酶标板，每孔100μL，4℃过夜后用PBS－T洗板3次。A5．2每孔加入含10％小牛血清的PBS-T100μL，于37℃下封板1h，洗板3次。A5．3待检血清用上液稀释为12∶，每孔加100μL，每份标本加两孔，37C温育1h，洗板3次。A5．4加入工作浓度的HRP标记单抗100μL371h℃后，洗板3次。A5．5加入OPD底物溶液100μL，3730min℃。A5．6加入2mol／LH2SO450μL，终止反应。A5．7测各孔OD490。A5．8对照设置和结果判定：每板设阳性对照一孔（5～10μg／mL抗原100μL），阴性血清对照三孔，以阴性对照OD均值＋3SD为阳性临界值。A6循环免疫复合物检测A6．1用0．01mol／LpH8．4硼酸盐缓冲液将PEG6000配成7％溶液，取此液100μL加等量12∶待检血清混合置室温下1h后，3000r／min离心1h。A6．2吸去上清液，在沉淀中加含有8mol／L尿素的0．05mol／LpH9．6碳酸盐缓冲液0．5mL，溶解沉淀物。A6．3用此液包被酶标板每孔100μL，每份标本包被两孔，4℃过夜后，洗板3次（阳性及阴性对照同样处理）。A6．4每孔加含有10％小牛血清的PBS－T100μL，37℃封板1h，洗板3次。A6．5加入工作浓度HRP标记的抗包虫单克隆抗体100μL，37℃下1h后洗板3次。A6．6加OPD底物100μL，37℃下30min。A6．7加入2mol／LH2SO450μL终止反应。A6．8测各孔OD490。A6．9对照设置和结果判定：每板设阳性对照一孔（同6．8项），阴性血清对照三孔，以阴性对照OD均值十3SD为阳性临界值。A7泡型包虫病特异性EITB技术A7．1抗原膜条制备及免疫印渍试验A7．1．1收取人工感染多房棘球蚴的长爪砂鼠腹腔中的包囊，剪碎后收集原头节，反复洗涤后，用去氧胆酸钠溶液溶解并抽提后，用PBS透析，收集抗原，测定蛋白质含量并调整至2mg／mL浓度。A7．1.2用12％或20％浓度聚丙烯酰胺凝胶或8％～16％梯度胶（厚1．5mm）按常规进行SDSPAGE电泳。在长度为6cm的胶上每一大孔加蛋白质400μg。电泳后按常规转移至硝酸纤维膜上（孔径0．45μm）。然后切成膜条，进行免疫印渍试验。待检血清稀释150∶。A7．2结果解释：在分子量为18KD位置出现酶免疫染色条带者为阳性。附录B（