双歧杆菌分离培养鉴定

1设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1恒温培养箱：36℃±1℃。2.2气相色谱仪配FID检测器。2.3冰箱：2℃～5℃。2.4天平：感量0.1g。2.5无菌试管：18mm×180mm、15mm×100mm。2.6无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器（200μL～1000μL）及配套吸头。2.7无菌锥形瓶：500mL、250mL。2.8显微镜2培养基和试剂3.1BS培养基3.2PYG培养基3.3TPY培养基3.4NPNL培养基3.5X-GAL培养基3.6氟化钠：化学纯。3.7碘乙酸钠或碘乙酸钾：化学纯。3.8果糖-6-磷酸盐：化学纯。3.9盐酸羟胺(HydroxyLamine-HCl)：化学纯。3.10三氯乙酸(TCA)：化学纯。3.11三氯化铁（FeCl3·6H2O）：化学纯。3.12甲醇:分析纯。3.13三氯甲烷：分析纯。3.14硫酸：分析纯。3.15冰乙酸：分析纯。3.16乳酸：分析纯。3.17乙酸标准溶液:吸取分析纯冰乙酸5.7mL,移入100mL容量瓶中,加水至刻度,标定,标定方法见附录B.1,此溶液浓度约为1mol/L。3.18乙酸标准使用液:将经标定的乙酸标准溶液用水稀释至0.01mol/L。3.19乳酸标准溶液:吸取分析纯乳酸8.4mL,移入100mL容量瓶中,加水至刻度,标定,标定方法见附录B.2，此溶液浓度约为1mol/L。3.20乳酸标准使用液:将经标定的乳酸标准溶液用水稀释至0.01mol/L。3双歧杆菌的分离和培养在无菌室内无菌称取1g双歧杆菌制剂，根据标示的活菌数量，用灭菌稀释液进行10倍梯度稀释至104-107，然后吸取0.2mL涂布于BS和NPNL琼脂平板上，放于厌氧培养箱内培养48到72小时.然后挑选菌落特征为光华、凸圆、边缘整齐、白色或乳脂色、质地柔软的中小菌落，接种于TPY琼脂平板上厌氧培养。待长出菌落后，每个平板选5个以上的特征菌落，先进行革兰氏染色，挑选具有双歧杆菌形态等特征的菌落，再进行需氧和厌氧培养，剔除需氧和厌氧都生长的菌落，选取仅厌氧培养生长的菌落，进一步在TPY琼脂平板上纯化菌株直至镜检为纯菌株。分纯后的菌株进行革兰氏染色，显微镜下观察其形态，然后进行鉴定，经鉴定是双歧杆菌的菌株在TPY液体培养基中增菌至平稳期，4℃，6000g×15min条件下离心收集菌体分散于20%灭菌脱脂中，然后在一30一40℃条件下冻干，冻干完成后，在真空条件下压盖，-18℃贮存。4厌氧培养法液体中的厌氧培养采用亨盖特厌氧培养技术(Min，1999;Chung，1997)。将配置好的培养基中加入0.01%亚甲基蓝作为氧指示剂，然后将其加热至沸腾，同时通入高纯氮气，5分钟后迅速将加热的培养基放入冷水中冷却至45℃，亚甲基蓝显示为无色则表示已经达到厌氧，迅速盖上橡胶塞，以上操作过程中均保持高纯氮气的不断通入。然后将培养基置于121℃，灭菌21分钟。5双歧杆菌的鉴定（1）镜检（2）在基础改良MRS培养基中添加X-Gal，对双歧杆菌进行检测双歧杆菌单独表面涂布呈白色或浅兰色，标准双歧杆菌表面涂布37℃48h培养后,双歧杆菌呈白色或浅兰色,边缘整齐,表面隆起部分显白色,菌落背面观察呈兰色底晕,随机挑取5个白色菌落经革兰氏染色涂片镜检,该菌为革兰氏阳性,呈各种分叉,V形,棍棒状,单个,成对,或链状排列,多种不规则形状,即可基本判定为双歧杆菌。6形态特征菌株在TPY固体平板上厌氧培养24小时，然后进行革兰氏染色，对其个体形态特征进行显微观察。同时把菌株接种平板上培养48小时，进行菌落形态观察。通过菌落及菌体形态可以看出:双歧杆菌菌落微小，光滑，乳白色，呈水样半透明或不透明，边缘整齐，凸起。菌体革兰氏染色呈阳性，并呈多形态性，菌体不规则，传代后，“V”字形和“Y”字形较少见。7生理生化检验糖发酵试验:在无菌操净台内将双歧杆菌合适稀释度的稀释液20mL接种到各糖发酵管中，37℃48h厌氧培养。触酶试验:挑取固体培养基18-24h内的菌落1接种环，置于洁净玻片上，滴加3%过氧化氢溶液数滴(新鲜配制)，观察结果。明胶液化试验:在无菌操净台内将待测菌株接种到装有明胶培养基的厌氧管中，放入37℃恒温培养箱中培养5-7天，然后置于4℃30分钟。同时准备两只未接种的厌氧管进行对照。吲哚试验:将菌液置于37℃恒温箱中培养4天，然后在菌液中加入吲哚试剂lmL。阳性:培养物与试剂接触处产生一红色的环状物。阴性:培养物仍为黄色。硝酸盐还原试验:在无菌操净台内将待测菌株接种于硝酸盐还原培养基中，置于37℃恒温箱中厌氧培养，分别在3d，5d时进行检测。检测时取培养液约0.smL于干净的试管中，先后滴入格里斯氏试剂A液、B液各2滴，如无红色出现，则加1-2滴二苯胺试剂，若出现蓝色，此菌株进行下一步检测。同时对培养液进行镜检，菌生长良好，且空白对照管加入格里斯氏试剂无红色出现时，以上检测结果有效。淀粉试验:在无菌操净台内将双歧杆菌合适稀释度的稀释液100µL接种到淀粉固体培养基上，用L棒涂布均匀，37℃48h倒置厌氧培养。附：糖发酵培养基:将PY基础培养基中加入1%的各种糖，再加溴甲酚紫一滴，115℃高压灭菌。触酶试剂:3%过氧化氢溶液(现用现配)。明胶试剂:将15%的明胶加入PY培养基中，115℃高压灭菌。吲哚试剂:对二甲基氨基苯甲醛1g95%酒精95mL浓盐酸50mL硝酸盐试剂:PYG培养基内加入1‰硝酸钾。格里斯氏试剂:A液:对氨基苯磺酸0.5g，10%稀醋酸150mLB液:α-萘酚0.1g，蒸馏水20mL，10%稀醋酸15OmL二苯胺试剂:对苯胺0.5g溶于IOOmL浓硫酸中，用20mL蒸馏水稀释淀粉试剂:在PY基础培养基中加入2%，115℃高压灭菌。双歧杆菌的分离培养鉴定方法流程操作步骤5.1样品制备5.1.1样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。5.1.2以无菌操作称取25g（或mL）样品，置于装有225mL生理盐水的灭菌锥形瓶内，制成1:10的样品匀液。5.2稀释步骤5.2.1用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1.0mL，沿管壁缓慢注于装有9mL生理盐水的无菌试管中（注意吸管尖端不要触及稀释液），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。5.2.2另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作顺序，做10倍递增样品匀液，每递增稀释一次，即换用1次1mL灭菌吸管或吸头。5.3纯培养挑取3个或以上的菌落接种于BBL琼脂平板，厌氧，36℃±1℃培养48h。5.3.1镜检及生化鉴定：5.3.1.1涂片镜检：双歧杆菌菌体为革兰氏染色阳性，不抗酸、无芽孢，无动力，菌体形态多样，短杆状、纤细杆状或球形，可形成各种分支或分叉形态。5.3.1.2生化鉴定：选取纯培养平板上的三个单个菌落，分别进行生化反应检测，不同双歧杆菌菌种主要生化反应见表1。5.4果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶（F6PPK）的测定,见附录B。5.5气相色谱法测定双歧杆菌的有机酸代谢产物,见附录B挥发性乙酸的测定:纯培养物2mL加50%硫酸0.1~0.2mL酸化-连续倒置混匀100次~加lmL乙醚~充分振摇5-10min~离心5min~取上层0.5.mL至另一有少许无水氯化钙的干净试管中~取2µL进行气相色谱分析。非挥发性乳酸的测定:纯培养物2mL加50%硫酸0.1一O.2mL酸化~加lmL甲醇溶液~60℃水浴1小时~加0.5mL氯仿~离心5min~取出试管用毛细吸管吸取底层0.2-0.4µL至另一有少许无水氯化钙的干净试管中~取2µL进行气相色谱分析。6报告根据5.3项镜检及生化反应结果、5.4项果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶（F6PPK）阳性结果和5.5项双歧杆菌的有机酸代谢产物乙酸与乳酸微摩尔之比大于1A.1BS培养基A.1.1成分用量酵母粉6.0g胰酶水解酪蛋白5.0g植物蛋白胨3.0g多胨3.0g葡萄糖10.0g可溶性淀粉0.5g蛋白胨7.0g西红柿浸出液200.0mL吐温801.0mL肝浸液150mL琼脂20.0g溶液A10mL溶液B5mL蒸馏水800mLL-半胱氨酸盐酸0.5gBS添加液50mLA.1.2制法A.1.2.1半胱氨酸盐溶液的配置：称取半胱氨酸0.5g，加入1.0mL盐酸，使半胱氨酸全部溶解，配制成半胱氨酸盐溶液。A.1.2.2西红柿浸出液的制备：将新鲜的西红柿洗净后称重切碎，加等量的蒸馏水在100℃水浴中加热，搅拌90min，然后用纱布过滤，校正pH7.0，将浸出液分装后，121℃高压灭菌15min～20min。A.1.2.3制法：(1)除BS添加液外，其他成分加热溶解，调pH至7.2，115.6℃高压灭菌20min，冷至50℃时加BS添加液，混匀倾注平皿。(2)BS添加液:丙酸钠30g加入灭菌烧瓶中，加灭菌蒸馏水80mL，待溶解后加硫酸新霉素400mg，巴龙霉素100mg，LiCl6g，再加灭菌蒸馏水至100mL，4℃保存。(3)溶液A:KH2PO425gK2HPO425g水250g(4)溶液B:MgSO4·7HO210gFeSO4·7HO20.5gNaC10.5gMnSO40.337g水250gNPNL培养基琼脂15g葡萄糖10g牛肉提取物3g肝浸液150ml植物蛋白胨3g蛋白胨10g溶液A10ml溶液B5ml吐温-801g胰蛋白酶5g酵母提取物5g可溶性淀粉0.5gNPNL溶液10mlL-半胱氨酸盐酸0.5g去离子水815ml1------溶液A，溶液B同上2-------NPNL溶液LiCl3g奈啶酮酸15g硫霉素100mg硫入龙霉素200mg水1000mA.2PYG液体培养基A.2.1成分用量蛋白胨10.0g葡萄糖2.5g酵母粉5.0g半胱氨酸-HCl0.25g盐溶液20.0mL维生素K1溶液0.5mL氯化血红素溶液2.5mL加蒸馏水至500.0mLA.2.2制法A.2.2.1盐溶液的配制：称取无水氯化钙0.2g，硫酸镁0.2g，磷酸氢二钾1.0g，磷酸二氢钾1.0g，碳酸氢钠10.0g，氯化钠2.0g，加蒸馏水至1000mL。A.2.2.2氯化血红素溶液（5mg/mL）的配制：称取氯化血红素0.5g溶于1mol/L氢氧化钠1.0mL中，加蒸馏水至1000mL，121℃高压灭菌15min～20min。A.2.2.3维生素K1溶液的配制：称取维生素K11.0g，加无水乙醇99mL，过滤除菌，冷藏保存。A.2.2.4制法：除氯化血红素溶液和维生素K1溶液外，A.2.1其余成分加入蒸馏水中，加热溶解，校正pH6.0，加入中性红溶液。分装后121℃高压灭菌15min～20min。临用时加热熔化琼脂，加入氯化血红素溶液和维生素K1溶液，冷至50℃使用。A.3TPY液体培养基A.3.1成分用量水解酪蛋白10.0g植物胨5.0g酵母粉2.0g葡萄糖5.0g磷酸氢二钾（K2HPO4·7H2O）2.0g氯化镁（MgCl2·6H2O）0.5g硫酸锌（ZnSO4·7H2O）0.25g氯化钙（CaCl2）0.15g氯化铁（FeCl3）0.1mg吐温-801.0mL蒸馏水至1000.0mLA.3.2制法：A.3.2.1半胱氨酸盐溶液的配置：称取半胱氨酸0.5g，加入1.0mL盐酸，使半胱氨酸全部溶解，配制成半胱氨酸盐溶液。A.3.2.2制法：将A.3.1成分加热溶解，然后加入半胱氨酸盐溶液，校正pH6.5±0.1，分装后121℃高压灭菌15min～20min附录B果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶与双歧杆菌的有机酸代谢产物检测方法B.1果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶（F6PPK）测定B.1.1试剂（1）0.05mol/L磷酸盐缓冲液pH6.5+500mg/L半胱氨酸-HCl。（2）6mg/mL氟化钠+10mg/mL碘乙酸钠或钾（3）果糖-6-磷酸盐（钠盐，70%-98%纯度）80mg/mL水溶液。（4）盐酸羟胺(HydroxyLamine-HCl)139mg/mL水溶液，使用时以NaOH中和至pH6.5。（5）15g/100mL三氯乙酸(TCA)水溶液。（6