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ICS65.120B46DB34安徽省地方标准DB34/T1377—2011尿液中莱克多巴胺的残留测定—胶体金免疫层析法DeterminationofRactopamineinUrinecolloidalgold2011-03-16发布2011-04-16实施安徽省质量技术监督局发布DB34/T1377—2011I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽省畜牧兽医局提出。本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：安徽省兽药饲料监察所(安徽省畜产品质量安全检测中心)。本标准主要起草人：汤春莲、许世富、陈文帮、丁作坤、陶小平、李珲。DB34/T1377—20111尿液中莱克多巴胺的残留测定—胶体金免疫层析法1范围本标准规定了用胶体金免疫层析法检测猪、牛尿液中残留的莱克多巴胺。本标准适用于猪、牛尿液中莱克多巴胺的残留快速检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3试样制备采集的尿液应保存于-18℃的冰柜中，用前恢复至室温，备用。4原理将氯金酸用还原法制成一定直径的金溶胶颗粒，标记抗体。硝酸纤维素膜为载体，利用了微孔膜的毛细管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移。在移动的过程中，会发生相应的抗原抗体反应，并通过免疫金的颜色而显示出来。样本中的莱克多巴胺在流动的过程中与胶体金标记的特异性单克隆抗体结合，抑制了抗体和硝酸纤维素（NC）膜检测线上莱克多巴胺－BSA偶联物的结合，使检测线不显颜色，结果为阳牲；反之，检测线显红色，结果为阴性。5试剂和材料5.1除非另有说明，本法所用试剂均为分析纯，水符合GB/T6682二级水的规定。5.2胶体金免疫层析快速检测装置组成5.2.1莱克多巴胺全抗原的偶联率为1：10～1：20（BSA：CL）。5.2.2抗莱克多巴胺抗体、多抗或单抗。多抗可以由兔或羊血清获得，效价应大于5000（间接ELISA法），或有效抗体含量应大于0.05mg/mL；特异性应大于5000（间接抑制ELISA法）。单抗由鼠腹水获得，效价应大于15000（间接ELISA法），或有效扰体含量应大于0.5mg/mL；特异性应大于5000（间接抑制ELISA法）。抗体相对亲和力为3.56×109（结合率下降50％时，相对应的抗体浓度的例数）。5.2.3样品垫：玻璃纤维或纸质薄片。5.2.4金释放垫：玻璃纤维片，免疫金释放时间小于5min，释放效率大于80％。5.2.5NC膜：孔径为0.45μm，4cm毛细管时间不小于140s。5.2.6吸水纸。DB34/T1377—201125.2.7底板。5.2.8塑料盒。5.3莱克多巴胺对照品，纯度不低于98.5％。5.4塑料吸管。5.5甲醇，色谱纯。5.6离心机。6实验步骤6.1溶液制备6.1.1莱克多巴胺储备液（1mg/mL）:准确称取莱克多巴胺对照品50mg，用甲醇溶解后稀释至50mL，摇匀，-18℃冰箱中贮存备用，有效期90d。6.1.2莱克多巴胺工作液（1μg/mL）:取莱克多巴胺储备液0.1mL，加甲醇定容至100mL，4℃冰箱中贮存备用，有效期7d。6.1.3阴性对照：取空白样品依法制备。6.1.4阳性对照（5ng/mL）：取莱克多巴胺工作液（6.1.2）100μL，用尿液稀释20mL，混匀。6.2样品检测6.2.1从包装袋中取出莱克多巴胺胶体金免疫层析快速检测装置，置于平整的台面上待测。检测装置应即开即用。6.2.2用塑料吸管吸取试样垂直滴加2滴无气泡上清液（约60μL～80μL）于加样孔内，每批需做阴性对照和阳性对照各一孔，加样方法同样本。6.2.3加样后5min～10min内观察结果。7结果判断7.1检测限本标准检测限为5ng/mL。7.2方法确认阴性对照出现红色条带，阳性对照不出现红色条带，说明检测装置有效，可进行检测；如阴性对照不出现红色条带，或阳性对照出现红色条带，出现任何一种现象或两种同时出现，说明检测装置失效，不能进行检测。7.3测定结果待检样品出现红色条带为阴性（不含莱克多巴胺或莱克多巴胺的含量＜5ng/mL）；待检样品不出现红色条带为阳性（莱克多巴胺的含量≥5ng/mL）。8结果确认阳性样品应用气相色谱－质谱法（GC/MS）或液相色谱质谱法（LC-/MS/MS）方法进行确认。_________________________________