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ICS65.020.20B22DB34安徽省地方标准DB34/T1434—2011抗虫和耐除草剂玉米Bt176及其衍生品种实时荧光PCR检测方法Real-timePCRmethodforinsect-resistantandherbicide-tolerantmaizeBt176anditsderivates2011-05-11发布2011-06-11实施安徽省质量技术监督局发布DB34/T1434—2011I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽省技术监督局提出。本标准由安徽省质量技术监督局归口。本标准起草单位：安徽省农业科学院水稻研究所和安徽省标准化研究院。本标准主要起草人：汪秀峰、杨剑波、李莉、陆徐忠、马卉、张士胜、倪大虎、宋丰顺、陈萍、倪金龙、杨亚春、张毅。DB34/T1434—20111抗虫和耐除草剂玉米Bt176及其衍生品种实时荧光PCR检测方法1范围本标准规定了转基因抗虫和耐除草剂玉米Bt176的实时荧光PCR转化体特异性检测方法。本标准适用于转基因抗虫和耐除草剂玉米Bt176及其衍生品种，以及相关制品中Bt176成分的实时荧光PCR定性检测方法。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法NY/T672转基因植物及其产品检测通用要求和定义NY/T673转基因植物及其产品检测抽样NY/T674转基因植物及其产品检测DNA提取和纯化农业部869号公告-8-2007抗虫和耐除草剂玉米BT176及其衍生品种定性PCR方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1基因zSSIIbzSSIIbgene玉米醇溶蛋白基因。3.2Bt176转化体特异性序列event-specificsequenceofBt176外源插入载体3’端与玉米基因组的连接区序列，包括bar基因部分序列和玉米基因组部分序列。3.3实时荧光PCRReal-timePCR通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量的分析。3.4阈值thresholdDB34/T1434—20112实时荧光PCR中以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。3.5Ct值cyclethreshold每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。4原理实时荧光PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监控整个PCR过程。TaqMan荧光PCR技术是以TaqMan荧光探针为基础，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。PCR扩增时加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。根据玉米内标准基因zSSIIb和Bt176转化体特异性序列，分别设计引物和探针进行PCR扩增，建立玉米内标准基因zSSIIb和Bt176转化体实时荧光PCR检测方法，根据检测结果判断试样中是否含有转基因成分Bt176。5试剂与材料除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合GB/T6682规定的一级水。5.1琼脂糖。5.270％乙醇（V/V）。5.310mg/mLRNaseA：将胰RNA酶（RNaseA）溶于10mmol/LTris-HCl(pH7.5)、15mmol/LNaCl中，配成10mg/mL的浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。5.410mol/LNaOH溶液:在160mL水中加入80.0g氢氧化钠（NaOH），溶解后再加水定容到200mL。5.5500mmol/L乙二铵四乙酸二钠溶液(pH8.0):称取乙二铵四乙酸二钠(EDTA-Na2)18.6g，加入70mL水中，再加入10mol/LNaOH溶液，加热溶解后，冷却至室温，再用10mol/LNaOH溶液调pH至8.0，加水定容到100mL，在103.4kPa(121℃)灭菌20min。5.6TE缓冲液（pH8.0):1mol/LTris-HCl（pH8.0）10mL和500mmol/LEDTA（pH8.0）溶液2mL，用水定容至1000mL。5.7dNTPs混合溶液:将浓度为10mmol/L的dATP，dCTP，dGTP，dTTP四种脱氧核糖核苷酸等体积混合。5.8适用于PCR反应的TaqDNA聚合酶（5U/μL）及其反应缓冲液。5.9引物和探针:序列信息应按附录A执行。用TE缓冲液（5.6）或重蒸馏水将上述引物和探针稀释到10μmol/L储存备用。注：探针应避光保存。5.10植物DNA提取试剂盒。5.11定量PCR反应试剂盒。DB34/T1434—201136仪器6.1分析天平：感量0.1g和0.1mg。6.2普通PCR仪和Real-timePCR仪。6.3重蒸水发生器或超纯水仪。6.4核酸定量仪。6.5其他相关仪器设备。7操作步骤7.1抽样和制样按NY/T672和NY/T673规定的执行。7.2试样预处理按NY/T674规定的执行。7.3DNA模板制备按NY/T674规定的执行，或使用经验证适用于玉米DNA提取和纯化的植物DNA试剂盒。7.4DNA提取质量测定紫外分光光度法检测核酸浓度的最佳范围是2μg/mL～50μg/mL。当提取的DNA溶液OD260nm/OD280nm的比值在1.7～2.0时，满足PCR检测要求。7.5对照设置在PCR反应的同时，应设置阴性对照和空白对照。以非转基因玉米DNA作为阴性对照PCR反应体系的模板；以转基因玉米Bt176DNA作为阳性对照的模板；以重蒸水作为空白对照PCR反应体系的模板。7.6PCR定性检测按农业部869号公告-8-2007规定的执行。当PCR反应体系正常工作时，试样中扩增出内标准基因zSSIIb，说明试样提取的DNA满足PCR检测要求。同时，对试样进行转化体Bt176的检测，若出现扩增条带，且扩增大小与预期片段大小一致，则初步判断样品中含有转化体Bt176，应通过实时荧光PCR进一步确认；若无扩增条带，则判定试样中不含有转化体Bt176。7.7实时荧光PCR检测7.7.1实时荧光PCR体系及反应条件。实时荧光PCR体系反应体系和反应条件参照附录B和附录C执行。反应体系和反应条件应根据试剂要求进行适当调整。每个反应体系设置3个平行。7.7.2质控标准DB34/T1434—20114在扩增内标准基因zSSIIb时，空白对照荧光曲线平直，阴性对照和阳性对照出现典型的扩增曲线，或空白对照荧光值低于阴性对照和阳性对照荧光值的15％，表明反应体系正常工作；在扩增检测转化体Bt176时，空白对照和阴性对照的荧光曲线平直，阳性对照出现典型的扩增曲线，且检测Ct值≤36或空白对照和阴性对照的荧光值低于阳性对照荧光值的15％，表明反应体系正常工作。否则，表明PCR反应体系不正常，需要查找原因重新检测。8结果分析与表述a)试样中内标准基因检测Ct值≤36，转化体Bt176检测Ct值≥40，则表明该试样中不含转基因成分Bt176。表述为“样品中未检测出抗虫和耐除草剂玉米Bt176，检测结果为阴性”。b)试样中内标准基因检测Ct值≤36，转化体Bt176检测Ct值≤36，则表明该试样中含有转基因成分Bt176。表述为“样品中检测出抗虫和耐除草剂玉米Bt176，检测结果为阳性”。c)试样中转化体Bt176检测Ct值在36～40，则需调整模板浓度，重新检测。经重复检测后，当检测体系正常时，转化体Bt176检测Ct值＜40，则表明该试样中含有转基因成分Bt176，表述为“样品中检测出抗虫和耐除草剂玉米Bt176，检测结果为阳性”；否则，表明该试样中不含转基因成分Bt176，表述为“样品中未检测出抗虫和耐除草剂玉米Bt176，检测结果为阴性”。9防污染措施转基因抗虫和耐除草剂玉米Bt176的实时荧光PCR检测过程的防污染措施应符合NY/T672的规定。DB34/T1434—20115AA附录A（规范性附录）实时荧光PCR检测引物和探针序列信息表A.1被检测基因引物或探针序列扩增长度/bpzSSIIb-F:5′-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3´zSSIIb-R:5′-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3´zSSIIbzSSIIb-P:5′-FAM-TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG-TAMRA-3´88bpBt176-F:5′-GTGCATCAATGGAGGAGAGAAC-3´Bt176-R:5′-GACTTCAGCCTGCCGGTACT-3´Bt176Bt176-P:5′-FAM-TCTCGGTGACGGGCAGGACC-TAMRA-3′77bpDB34/T1434—20116BB附录B（规范性附录）实时荧光PCR检测反应体系表B.1试剂终浓度体积水8µL2×TaqManMix1×12.5µL10µmol/L上游引物0.4µmol/L1µL10µmol/L下游引物0.4µmol/L1µL10µmol/L探针0.2µmol/L0.5µL25mg/LDNA模板2mg/L2.0µL总体积25.0µL注1：如果PCR缓冲液中含有氯化镁，则不加氯化镁溶液，加等体积无菌水。注2：玉米内标准基因PCR检测反应体系中，上下游引物和探针分别为zSSIIb–F/R和zSSIIb–P；转基因玉米Bt176转化体PCR检测反应体系中，上下游引物和探针分别为Bt176–F/R和Bt176-P。DB34/T1434—20117CC附录C（规范性附录）实时荧光PCR检测反应条件表C.1被检测基因预变性扩增循环数zSSIIbBt17695℃,10min95℃,15s；60℃,1min读板40_________________________________