DB34T 1838-2013 动物源性组织中硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方法 高效液相色谱荧光法

ICS67.120X04DB34安徽省地方标准DB34/T1838—2013动物源性组织中硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方法高效液相色谱荧光法Determinationofresiduesofnitrofuranmetabolitesinanimaltissue-HPLCfluorescentmethod2013-02-04发布2013-03-04实施安徽省质量技术监督局发布DB34/T1838—2013I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽省质量技术监督局、安徽省食品质量安全检验方法标准化技术委员会提出。本标准由安徽省食品质量安全检验方法标准化技术委员会归口。本标准起草单位：阜阳师范学院、亳州市产品质量监督检验所、安徽国家农业标准化与监测中心。本标准主要起草人：盛良全、陈明明、胡晓娟、王志强、吴平华、徐华杰、杜娜娜。DB34/T1838—20131动物源性组织中硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方法高效液相色谱荧光法1范围本标准规定了动物源性组织中硝基呋喃类药物代谢物3-氨基2-唑烷基酮（AOZ）、5-吗啉甲基-3-氨基-2-唑烷基酮（AMOZ）、1-氨基-乙内酰脲（AHD）和氨基脲（SEM）残留量的高效液相色谱荧光测定方法。本标准适用于动物源性组织中硝基呋喃类药物代谢物3-氨基-2-唑烷基酮、5-吗啉甲基-3-氨基-2-唑烷基酮、1-氨基-乙内酰脲和氨基脲残留的定量测定。本标准适用于该产品的风险预警监测及相关科学研究。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理样品经稀盐酸水解，在50℃水浴下用2-羟基-1-萘甲醛衍生2h，然后，用乙酸乙酯提取。净化后采用高效液相色谱法（荧光检测器）测定，外标法定量。4试剂和材料4.1试剂：除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682规定的一级水。4.2甲醇：色谱纯。4.3乙腈：色谱纯。4.4乙酸乙酯：色谱纯。4.5浓盐酸：优级纯。4.6氢氧化钠：优级纯。4.7硼酸。4.82-羟基-1-萘甲醛（2-NAH）：含量≥99％。4.9氯化钾。4.100.40mol/L盐酸溶液：准确量取33.30mL浓盐酸(4.4)，用水定容至1L。4.110.50mol/L氢氧化钠溶液：准确称取5g氢氧化钠(4.5)，用水溶解并定容至250mL。4.120.025mol/L2-羟基-1-萘甲醛溶液：准确称取0.4305g2-羟基-1-萘甲醛（4.7)，用甲醇溶解并定容至100mL。DB34/T1838—201324.13标准物质：3-氨基-2-恶唑酮、5-吗啉甲基-3-氨基-2-恶唑烷基酮、1-氨基-乙内酰脲、氨基脲，纯度≥99％。4.14标准储备液：分别准确称取适量标准品（精确至0.0001g），用甲醇溶解，配制成浓度为400mg/L的标准储备溶液，-18℃冷冻避光保存，有效期3个月。4.15混合中间标准溶液：准确移取标准储备液(4.13)各1mL于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成浓度为40mg/L的混合中间标准溶液，4℃冷藏避光保存，有效期1个月。4.16混合标准工作溶液：准确移取0.5mL混合中间标准溶液(4.14)于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成浓度为2mg／L的混合标准工作溶液，4℃冷藏避光保存，有效期1周。建议现配现用。4.17微孔滤膜：0.45μm的有机系和水系滤膜。4.18氮气：纯度≥99％。5仪器和设备5.1高效液相色谱仪：配备多波长荧光检测器。5.2组织捣碎机。5.3分析天平：感量0.0001g、0.01g。5.4数显恒温水浴锅。5.5pH计：测量精度±0.02pH单位。5.6高速冷冻离心机：10000r/min。5.7台式离心机：4000r/min。5.8氮吹仪。5.9超声波清洗机。5.10容量瓶：lL、100mL、50mL、25mL、10mL。5.11具塞塑料离心管：50mL。5.12刻度试管：l0mL。5.13微量进样器100µL、50µL、10µL。6试样制备与保存从原始样品取出有代表性样品约500g，用组织捣碎机充分捣碎混匀，装入洁净容器作为试样，密封，并标明标记，将试样置于-18℃冷冻避光保存。注：在制样的操作过程中，应防止样品污染或残留物含量发生变化。7样品处理7.1水解和衍生化称取约5.00g试样（精确至0.0lg）于50mL塑料离心管中，加入10mL甲醇-0.40mol/L盐酸混合溶液（7+3，体积比），混匀超声40min后，再加入0.20g氯化钾，混匀后再超声30min，然后，以7200r/min离心40min，倾倒上清液于10mL玻璃试管中，再加入2-羟基-1-萘甲醛溶液(4.7)200μL，振荡摇匀后超声10min，置50℃恒温水浴锅中反应2h。7.2提取和净化DB34/T1838—20133取出样品，冷却至室温，在60℃下用氮气吹至1mL，加入4mL超纯水，再加入5mL乙酸乙酯，振荡提取5min后，以10000r/min离心5min，收集乙酸乙酯层，残留物用5mL乙酸乙酯再提取一次，合并乙酸乙酯层。收集液在40℃下用N2吹至近干后用1mL的乙腈水溶液(V乙腈:V水=8:2)重新复溶，用0.45μm有机滤膜过滤后,转移入进样瓶待进样。7.3工作曲线移取适量AMOZ、AHD、AOZ、SEM混合标准工作溶液，添加到10mL甲醇-0.40mol/L盐酸混合溶液（7+3，体积比）中，使其浓度分别为0.5ng/mL、2.5ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL和20.0ng/mL，按7.1～7.2测定步骤处理，用高效液相色谱仪测定，绘制标准工作曲线。或采用与待测物相近浓度的标样进行单点测定。8测定8.1液相色谱条件8.1.1色谱柱：YMC-PackPolymerC18，250×4.6mml.D.S-6µm，或相当者；8.1.2柱温：40℃；8.1.3流速；0.7mL/min；8.1.4进样量：20μL；荧光检测条件:灵敏度（EUFS）：500，增益（Gain）:10；通道1：激发波长(Ex):395nm发射波长(Em)：463nm；通道2：激发波长(Ex):260nm发射波长(Em)：463nm；8.1.5流动相及洗脱条件见表1。表1流动相及梯度洗脱条件时间min流动相A:0.01mol/L硼酸缓冲液（pH=10.30）流动相B:乙腈-0.01mol/L硼酸缓冲液（pH=9.40，体积比50:50）0.0070％30％3.0050％50％8.0015％85％35.0015％85％40.0070％30％45.0070％30％8.2平行试验按照以上步骤对同一试样进行平行试验测定。8.3空白试验除不称取试样外，均按照以上步骤进行。9结果计算按式(1)进行计算：DB34/T1838—20134mAVCACSS.....................................(1)式中：C——试样中分析物的含量，单位为微克每千克(μg／kg)；Cs——从工作曲线中得到与被测组分相近的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；A——被测试样的峰面积；As——对应Cs标准的峰面积；V——样液最终定容体积，单位为毫升(mL)；m——样品溶液所代表最终试样的质量，单位为克(g)。注：计算结果需将空白值扣除。10方法灵敏度、回收率和精密度10.1灵敏度本方法AMOZ、AOZ、AHD、SEM的检出限（LOD）低于0.5μg／kg；最低定量限(LOQ):AMOZ、AOZ均0.5μg／kg，AHD、SEM均1.0μg／kg。10.2回收率添加浓度在1μg／kg、5μg／kg、10μg／kg时，AMOZ、AOZ、AHD、SEM回收率在80％～115％之间。10.3精密度本方法批内和批间相对标准偏差≤15％。DB34/T1838—20135AA附录A（资料性附录）四种硝基呋喃代谢物实际样品荧光色谱图图A.1样品基质添加四种硝基呋喃类代谢物标样色谱图（激发波长：395nm，发射波长：463nm）图A.2样品基质添加四种硝基呋喃类代谢物标样色谱图（激发波长：260nm，发射波长：463nm）_________________________________