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ICSDB34安徽省地方标准DB34/T1729—2012窖泥中脱氢酶活性的分析方法MethodofanalysisfordehydrogenaseactivityofPidMud文稿版次选择2012-11-06发布2012-12-06实施安徽省质量技术监督局发布DB34/T1729—2012I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽古井贡酒股份有限公司提出并负责起草。本标准由安徽省浓香型白酒标准化技术委员会归口。本标准主要起草人：周庆伍、李安军、万春环、汤有宏、袁志强、刘国英、高江婧。DB34/T1729—20121窖泥中脱氢酶活性的分析方法1范围本标准规定了窖泥中脱氢酶活性的分析方法。本标准适用于浓香型白酒窖泥中脱氢酶活性的分析。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其昀新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1脱氢酶活性dehydrogenaseactivity在本方法规定的分析步骤条件下，每1g绝干窖泥lh产生1μg三苯基甲月替（TF）的量为一个酶活力单位。4原理利用无色的氯化三苯基四氮唑（TTC，2，3，5-triphenyltetrazoliumchloride），接受氢后变成红色的三苯基甲月替（TF，triphenylformazan），根据产生红色进行比色定量分析，以判断脱氢酶活性。根据红色的深浅，测出相应的吸光度（A值），求出脱氢酶活性。A值越大（红色深），脱氢酶活性越高。TTC作为受氢体，其还原过程可用下式表示：5试剂本标准所用水在未注明其他要求时，均指符合GB/T6682中三级以上（包括三级）要求的水；本标准中所用试剂，在未注明特殊要求时，均指分析纯（A.R）。DB34/T1729—201225.14g/LTTC溶液：准确称取0.4g（精确至0.0001g）TTC（2，3，5-氯化三苯基四氮唑）和2g（精确至0.01g）葡萄糖溶于少量蒸馏水中，再稀释到100mL的容量瓶中贮存于棕色瓶中，一周更换一次。5.2Tris-HCl缓冲液（pH=8.16）：准确称取6.0370g（精确至0.0001g）Tris（三羟甲基氨基甲烷），再加入20.0mL1.00mol/L的盐酸，再定容至1000mL。5.30.36％Na2SO3溶液:0.36g（精确至0.0001g）亚硫酸钠定容到100mL容量瓶中。5.4连二亚硫酸钠。5.50.9％生理盐水。5.6丙酮。5.7甲醛。6仪器6.1分光光度计。6.2数显水浴锅。6.3分析天平（感量0.0001g）。6.4离心机（4000rpm）。7分析步骤7.1绘制TTC标准曲线7.1.1配制系列浓度的TTC标准溶液先取5支50mL具塞比色管，按顺序尽快分别加入0.36％Na2SO3溶液（5.3）2.50mL，Tris-HCl缓冲液（5.2）7.50mL，再分别吸取4g/LTTC溶液（5.1）0.10mL、0.20mL、0.30mL、0.40mL、0.50mL，放入5支比色管中，用蒸馏水定容至50mL，使成8μg/mL、16μg/mL、24μg/mL、32μg/mL、40μg/mL系列浓度。同时另取一支50mL比色管，加入0.36％Na2SO3溶液（5.3）2.50mL，Tris-HCl缓冲溶液（5.2）7.50mL，加入蒸馏水至50mL，作为空白对照。7.1.2TTC还原反应取6支10mL具塞比色管，分别吸取5.00mL上述系列溶液（按浓度从小到大顺序依次吸取），向每支比色管中各加入0.10g连二亚硫酸钠（5.4）粉末混匀，使TTC全部还原成红色的TF。7.1.3测定吸光度向上述各管加入0.50mL甲醛终止反应，摇匀后加入5.00mL丙酮振荡摇匀，37℃水浴10分钟；4000rpm离心5分钟，吸取上清液5.00mL在485nm波长下测定吸光度A值，比色皿光程为1cm；以A值为纵坐标，TTC浓度为横坐标，绘制出TTC标准曲线。7.2窖泥脱氢酶活性的测定7.2.1窖泥悬浮液的制备DB34/T1729—20123称取10.0g鲜窖泥（其水分记作w，用百分数表示），放入150mL三角瓶中，加50mL0.9％生理盐水，用玻璃棒将窖泥打碎，倒入100mL容量瓶中，再加0.9％生理盐水定容至100mL，倒回三角瓶中，半小时内振摇三次，使其充分摇匀。7.2.2TTC还原反应取若干10mL具塞比色管，分别加入0.36％Na2SO3溶液（5.3）0.50mL，Tris-HCL缓冲液（5.2）2.00mL，窖泥悬浮液2.00mL（吸前摇匀），4g/LTTC液（5.1）0.50mL（对照管不加TTC液，以0.50mL蒸馏水取代），盖紧塞子，将比色管摇匀；将摇匀后的比色管立即放入37℃水浴中培养，至显示红色为止。一般新培养窖泥需16h至24h，老窖泥需5h左右（以显色为准）。培养时每隔1h振荡摇匀，显色时间（h）记作t。注：所有操作应当尽量在避光条件下进行。脱氢酶昀适反应条件，温度35℃～40℃，pH值7.4～8.5。7.2.3测定向各管分别加入0.50mL甲醛终止反应，摇匀后再向各管分别加入5.00mL丙酮振荡摇匀，在37℃水浴中保温10分钟；把各管分别倒入50mL离心管中，4000rpm离心5分钟，吸取上清液5.00mL，在485nm波长下测定吸光度A值，比色皿光程为1cm，并在标准曲线上查出相应的TTC浓度，记作c（μg/mL）。注：当吸光度A值大于0.8时，要适当稀释，使A值在0.8以下。8计算脱氢酶活性)1(251002)-(110.05wtcwtc−×=×××=.......................(1)式中：c——由标准曲线上查出的TTC浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；t——显色时间，单位为小时（h）；w——鲜窖泥的水分，单位用百分数表示（％）。所得结果表示至一位小数。9精密度在重复性条件下，两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15％。_________________________________