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ICS01.040.67X04DB34安徽省地方标准DB34/T2562—2015大曲酯酶活力的检测酶联免疫法（ELISA）DeterminationofesteraseactivityinDaqu—Enzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)文稿版次选择2015-12-30发布2016-01-30实施安徽省质量技术监督局发布DB34/T2562—2015I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽省浓香型白酒标准化技术委员会提出并归口。本标准起草单位：安徽瑞思威尔科技有限公司、安徽古井贡酒股份有限公司、安徽农业大学。本标准主要起草人：周庆伍、李安军、蒋军、汤有宏、江昌俊、梁绍勋、李晓欢、何宏魁、吴文睿、刘国英、汪君、李红歌、马侠。DB34/T2562—20151大曲酯酶活力的检测酶联免疫法（ELISA）1范围本标准规定了大曲酯酶活力的检测酶联免疫法。本标准适用于大曲酯酶活力的测定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1酯酶活力单位esteraseactivityunit在37℃、pH6.0条件下，15min水解α-乙酸萘酯转化为α-萘酚，每产生1nmolα-萘酚为1个酯酶活力单位（U）。4原理试样中的酯酶与微孔中包被的羧酸酯酶抗体结合，在酶标记物的作用下，形成的酶标抗体抗原复合物与显色剂发生反应，用酶标仪测定吸光度，根据吸光度值得出试样中酯酶活力。5试剂和材料5.1本实验所用试剂除非另有说明，均为分析纯，水为符合GB/T6682二级水。5.2酯酶试剂盒：2～8℃冰箱中保存。注：不同品牌的酯酶试剂盒其操作步骤可能有所不同，溶液配制和测试程序等可根据其试剂盒使用说明书略作调整。5.2.1包被羧酸酯酶抗体的聚苯乙烯微量反应板。5.2.2羧酸酯酶标准品：450U/L。5.2.3羧酸酯酶标记物。5.2.4羧酸酯酶标准品稀释液。5.2.5试样稀释液。5.2.6洗板母液。DB34/T2562—201525.2.7显色剂A。5.2.8显色剂B。5.2.9反应终止液。5.3磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）：优级纯。5.4磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）：优级纯。5.5氯化钠（NaCl）：优级纯。5.6磷酸盐缓冲溶液：pH=7.4。分别称取0.62g磷酸二氢钠(5.3)、5.73g磷酸氢二钠(5.4)和9g氯化钠(5.5)，加水溶解至1000mL，在pH计上调节溶液pH=7.4。5.7羧酸酯酶标准溶液：根据酯酶试剂盒（5.2）的线性范围，用羧酸酯酶标准品稀释液（5.2.4）将羧酸酯酶标准品（5.2.2）稀释成不同活力的标准工作溶液，每次测定现配现用。5.8洗涤液：将洗板母液（5.2.6）按照酯酶活力试剂盒中规定的比例用水稀释，混匀后备用。6仪器和设备6.1酶标仪（配备450nm滤光片）。6.2分析天平：感量1mg6.3冷冻离心机。6.4振荡器。6.5恒温培养箱。6.6超声波细胞破碎仪。6.7pH计。7测定步骤7.1粗酶液制备7.1.1称取0.1～0.5g试样，精确到0.001g，置于100mL烧杯中，加50mL磷酸盐缓冲溶液（5.6），振荡10min。将烧杯置于超声波细胞破碎仪（6.6）中，超声探头直径6～8mm、超声温度4～8℃、超声时间3～5s、间歇时间3～5s、超声功率300～350W、总超声时间5～10min，制成试样液。7.1.2试样液于4～8℃、5000r/min离心10min，取1mL上清液于250mL容量瓶中，加磷酸盐缓冲溶液（5.6）至刻度，摇匀，制成粗酶液。保存过程中如有沉淀，应再次离心。7.2测试程序7.2.1以下所有操作应在20～25℃室温下进行。7.2.2酶标仪测定条件：酶标仪测定波长450nm。7.2.3酯酶试剂盒（5.2）中所有的试剂的温度均应回升到室温（20～25℃）后方可使用。7.2.4洗板条件7.2.4.1人工洗板次数5次以上，每次注水量250μL。7.2.4.2自动洗板可以设定5个周期。7.2.5记录空白、标准品和试样在微孔板上的位置。7.3测定DB34/T2562—201537.3.1吸取50μL羧酸酯酶标准工作溶液（5.7）依次加入标准溶液孔底部。吸取40μL试样稀释液（5.2.5）加入试样孔底部，再加10μL粗酶液（7.1），混合均匀。7.3.2封板膜封板后置于37℃恒温培养箱（6.5）中孵育30min。7.3.3取出微量反应板，弃去液体，甩干，立即用洗涤液（5.8）按7.2.4条件进行洗板，每次静置30s后甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干。7.3.4吸取50μL羧酸酯酶标记物（5.2.3）于空白孔外的每一个微孔。用封板膜密封孔口，于37℃孵育30min。7.3.5按7.3.3步骤重复操作。7.3.6加入50μL显色剂A（5.2.7）和50μL显色剂B（5.2.8）于每一个微孔底部，摇匀后于37℃孵育30min。7.3.7迅速加入反应终止液（5.2.9）50μL于每一个微孔底部，摇匀（此时蓝色立转黄色）。7.3.8将微量反应板置于酶标仪（6.1）中，在450nm处用空白孔调零点，测定吸光度(加入反应终止液后应在15min内读取吸光度)。7.4平行试验按以上步骤同一标准溶液、同一样品溶液进行平行试验测定。7.5空白试验除不称取试样外，其它均按上述步骤进行。8结果计算以吸光度值为纵坐标，酯酶的活力（U/L）为横坐标，绘制标准工作曲线。从标准工作曲线上得到试样中相应的酯酶活力，结果按公式（1）进行计算。.................................(1)式中：X———-大曲酯酶活力，单位为活力单位/克（U/g）；C———从标准工作曲线上得到的试样酯酶活力，单位为活力单位/升（U/L）；V———试样液体积,单位为毫升(mL)；n────试样液稀释倍数；m────试样的质量,单位为克（g）。注：计算结果保留2位有效数字。9精密度重复测定结果的相对偏差不得超过15％。_________________________________