DB34T 3283-2018 副猪嗜血杆菌的分子分型MLST方法

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ICS11.220B41DB34安徽省地方标准DB34/T3283—2018副猪嗜血杆菌的分子分型MLST方法MultilocussequencetypingdetectionmethodforHaemophilusparasuis文稿版次选择2018-12-29发布2019-01-29实施安徽省市场监督管理局发布DB34/T3283—2018I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽农业大学提出。本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位:安徽农业大学、安徽浩翔农牧有限公司、安徽省动物卫生监督所、阜阳市动物卫生监督所、合肥市动物疫病预防与控制中心、安徽省兽药饲料监察所、同济大学。本标准主要起草人:李郁、陈章、李雪松、张利亚、黄晓慧、刘晓露、孙裴、汪清峰、张劲松、高亚飞、孟天恺。DB34/T3283—20181副猪嗜血杆菌的分子分型MLST方法1范围本标准规定了副猪嗜血杆菌的分子分型MLST的术语和定义、试剂和材料、仪器和设备、操作步骤、生物安全及防污染措施。本标准适用于副猪嗜血杆菌的分子分型检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫NY/T2417副猪嗜血杆菌PCR检测方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1管家基因house-keepinggenes所有细胞中均要表达的一类基因,其产物是维持细胞生命活动所必需的,其基因序列高度保守并且在大多数情况下持续表达。4试剂和材料除有特殊说明外,所有实验用试剂均为分析纯;实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。4.1细菌基因组DNA提取试剂盒。4.2普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒。4.3TaqDNA酶。4.4dNTP:dATP、dTTP、dCTP、dGTP。4.5引物:扩增引物和测序引物序列见附录A表A.2。4.610×PCR缓冲液:200mmoI/LTris-HCl(pH8.4),200mmol/L氯化钾,15mmol/L氯化镁。4.7琼脂糖凝胶。4.8Gelred核酸染色剂。4.96×溴酚蓝上样缓冲液。DB34/T3283—201824.10分子量标记:1000bpDNAmarker。4.115×TBE电泳缓冲液:445mmoI/LTris,445mmol/L硼酸,10mmol/LEDTA(pH8.0)。使用时稀释为0.5×TBE电泳缓冲液。4.12质控菌株:副猪嗜血杆菌。5仪器和设备5.1离心机:最大转速14000r/min以上。5.2天平:量程2kg,感量0.1g。5.3pH计。5.4涡旋振荡器。5.5PCR仪。5.6电泳仪。5.7凝胶成像仪。5.8超净工作台5.9微量移液器:0.1µL~2.5µL、0.5µL~10µL、5µL~50µL、20µL~200µL、100µL~1000µL。6操作步骤6.1细菌基因组DNA提取采用细菌基因组DNA提取试剂盒,提取经过NY/T2417的方法鉴定为副猪嗜血杆菌的DNA。6.2MIST基因选择按附录A表A.1所示,对副猪嗜血杆菌的7个管家基因进行MLST分析。6.3PCR扩增引物和测序引物的选择按附录A表A.2中的序列,合成副猪嗜血杆菌7个管家基因对应的7对PCR扩增引物和测序引物。引物在使用前按照引物合成时的既定浓度进行稀释到10µmol/L,-20℃保存备用。6.4管家基因片段的PCR扩增反应体系体积为50µL:10×PCR缓冲液5µL、dNTP(2.5mmol/L)4µL、上下游引物各(10µmol/L)1µL、TaqDNA聚合酶(5U/µL)0.5µL、模板DNA5µL、去离子水补齐至50µL。反应条件为:预变性95℃5min;变性95℃60s,退火45℃30s,延伸72℃30s,进行35个循环;72℃再延伸10min。将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,在波长为256nm的紫外光下成像观察,出现标准Marker条带和依次单一且明亮的条带时,对相应样品进行PCR产物纯化。6.5PCR产物纯化利用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒并按照试剂盒所规定的操作步骤对PCR产物进行纯化。6.6DNA序列测定DB34/T3283—20183采用附录A表A.2的测序引物,对纯化的PCR产物进行DNA序列双向测序。6.7结果报告将所得到的副猪嗜血杆菌7个管家基因测序结果与GenBank中的已有的相关基因进行BLAST,然后使用Lasergene7.1对序列进行ClustalV分析,将上下游序列整合后得到完整序列,为减小误差首尾的几个碱基不计算入序列测定结果。最后将测序结果上传至MLST网站()进行在线数据分析,得到的结果与MLST数据库进行比对。将所得到的副猪嗜血杆菌7个管家基因核酸扩增片段DNA序列进行MLST分析,获得菌株所对应的等位基因图谱,确定副猪嗜血杆菌分离株的序列型(SequenceType,ST),并与PubMLST数据库中国际菌株的资料进行比较。在确定STs的基础上应用eBURST程序将菌株分为各个谱系组(clonalcomplex),构建系统遗传进化树(参见附录B)。7生物安全及防污染措施7.1生物安全措施按照GB19489中的有关规定执行。7.2防污染措施防污染措施应符合GB/T27401的规定。DB34/T3283—20184AA附录A(规范性附录)副猪嗜血杆菌多位点序列分型的管家基因及引物序列表A.1副猪嗜血杆菌的管家基因基因名称片段大小bp管家基因名称atpD519ATP合成酶β链基因(βchainofATPsynthase)infB399翻译起始因子IF-2基因(translationinitiationfactorIF-2)mdh444苹果酸脱氢酶基因(malatedehydrogenasegene)rpoB330核糖体蛋白β亚基基因(ribosomalproteinβsubunit)6pgd4656-磷酸葡萄糖脱氢酶基因(6-phosphogluconatedehydrogenase)g3pd4413-磷酸甘油醛脱氢酶基因(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)frdB453延胡索酸还原酶基因(fumaratereductaseB)表A.2副猪嗜血杆菌管家基因扩增(测序)的引物序列引物名称序列(5’→3’)atpD(Forward)atpD(Reverse)infB(Forward)infB(Reverse)mdh(Forward)mdh(Reverse)rpoB(Forward)rpoB(Reverse)6pgd(Forward)6pgd(Reverse)3gpd(Forward)3gpd(Reverse)frdB(Forward)frdB(Reverse)CAAGATGCAGTACCAAAAGTTTAGACCTTCATCACGGAATTTCTATATCCGTAAAGCGAAAGTACGACCTTTATCGAGGTAAGGCACTTTATGATATTGCCCCTTCCGTACCTGCATTTTGCTTCGGTTCATCACAACTTTCCGTCCATATAGTGAATTTCTTCAAACCACGCAAAGTGATGTCGTTGATCTTTGAATGAAGAGGTCAAGACATCGTTTCTAACTCTAATACTTTGTTTGAGTAACCAGGTTGGTCTTGCCGTATGGTTAGCACTTTCGATCTTACCTTDB34/T3283—20185BB附录B(规范性附录)系统遗传进化树的构建将所得到的副猪嗜血杆菌7个管家基因核酸扩增片段DNA序列进行MLST分析,获得菌株所对应的等位基因图谱,确定副猪嗜血杆菌分离株的序列型(SequenceType,ST),并与PubMLST数据库中国际菌株的资料进行比较。在确定STs的基础上应用eBURST程序将菌株分为各个谱系组(clonalcomplex),构建系统遗传进化树。图B.1为副猪嗜血杆菌进行MLST分析后绘制的系统遗传进化树图。图B.1副猪嗜血杆菌系统遗传进化树图_________________________________

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