DB34T 3283-2018 副猪嗜血杆菌的分子分型MLST方法

ICS11.220B41DB34安徽省地方标准DB34/T3283—2018副猪嗜血杆菌的分子分型MLST方法MultilocussequencetypingdetectionmethodforHaemophilusparasuis文稿版次选择2018-12-29发布2019-01-29实施安徽省市场监督管理局发布DB34/T3283—2018I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由安徽农业大学提出。本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：安徽农业大学、安徽浩翔农牧有限公司、安徽省动物卫生监督所、阜阳市动物卫生监督所、合肥市动物疫病预防与控制中心、安徽省兽药饲料监察所、同济大学。本标准主要起草人：李郁、陈章、李雪松、张利亚、黄晓慧、刘晓露、孙裴、汪清峰、张劲松、高亚飞、孟天恺。DB34/T3283—20181副猪嗜血杆菌的分子分型MLST方法1范围本标准规定了副猪嗜血杆菌的分子分型MLST的术语和定义、试剂和材料、仪器和设备、操作步骤、生物安全及防污染措施。本标准适用于副猪嗜血杆菌的分子分型检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫NY/T2417副猪嗜血杆菌PCR检测方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1管家基因house-keepinggenes所有细胞中均要表达的一类基因，其产物是维持细胞生命活动所必需的，其基因序列高度保守并且在大多数情况下持续表达。4试剂和材料除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。4.1细菌基因组DNA提取试剂盒。4.2普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒。4.3TaqDNA酶。4.4dNTP：dATP、dTTP、dCTP、dGTP。4.5引物：扩增引物和测序引物序列见附录A表A.2。4.610×PCR缓冲液：200mmoI/LTris-HCl（pH8.4），200mmol/L氯化钾，15mmol/L氯化镁。4.7琼脂糖凝胶。4.8Gelred核酸染色剂。4.96×溴酚蓝上样缓冲液。DB34/T3283—201824.10分子量标记：1000bpDNAmarker。4.115×TBE电泳缓冲液：445mmoI/LTris，445mmol/L硼酸，10mmol/LEDTA(pH8.0）。使用时稀释为0.5×TBE电泳缓冲液。4.12质控菌株：副猪嗜血杆菌。5仪器和设备5.1离心机：最大转速14000r/min以上。5.2天平：量程2kg，感量0.1g。5.3pH计。5.4涡旋振荡器。5.5PCR仪。5.6电泳仪。5.7凝胶成像仪。5.8超净工作台5.9微量移液器：0.1µL～2.5µL、0.5µL～10µL、5µL～50µL、20µL～200µL、100µL～1000µL。6操作步骤6.1细菌基因组DNA提取采用细菌基因组DNA提取试剂盒，提取经过NY/T2417的方法鉴定为副猪嗜血杆菌的DNA。6.2MIST基因选择按附录A表A.1所示，对副猪嗜血杆菌的7个管家基因进行MLST分析。6.3PCR扩增引物和测序引物的选择按附录A表A.2中的序列，合成副猪嗜血杆菌7个管家基因对应的7对PCR扩增引物和测序引物。引物在使用前按照引物合成时的既定浓度进行稀释到10µmol/L，-20℃保存备用。6.4管家基因片段的PCR扩增反应体系体积为50µL:10×PCR缓冲液5µL、dNTP(2.5mmol/L)4µL、上下游引物各(10µmol/L)1µL、TaqDNA聚合酶(5U/µL)0.5µL、模板DNA5µL、去离子水补齐至50µL。反应条件为：预变性95℃5min；变性95℃60s，退火45℃30s，延伸72℃30s，进行35个循环；72℃再延伸10min。将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，在波长为256nm的紫外光下成像观察，出现标准Marker条带和依次单一且明亮的条带时，对相应样品进行PCR产物纯化。6.5PCR产物纯化利用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒并按照试剂盒所规定的操作步骤对PCR产物进行纯化。6.6DNA序列测定DB34/T3283—20183采用附录A表A.2的测序引物，对纯化的PCR产物进行DNA序列双向测序。6.7结果报告将所得到的副猪嗜血杆菌7个管家基因测序结果与GenBank中的已有的相关基因进行BLAST，然后使用Lasergene7.1对序列进行ClustalV分析，将上下游序列整合后得到完整序列，为减小误差首尾的几个碱基不计算入序列测定结果。最后将测序结果上传至MLST网站()进行在线数据分析，得到的结果与MLST数据库进行比对。将所得到的副猪嗜血杆菌7个管家基因核酸扩增片段DNA序列进行MLST分析，获得菌株所对应的等位基因图谱，确定副猪嗜血杆菌分离株的序列型（SequenceType，ST），并与PubMLST数据库中国际菌株的资料进行比较。在确定STs的基础上应用eBURST程序将菌株分为各个谱系组（clonalcomplex），构建系统遗传进化树（参见附录B)。7生物安全及防污染措施7.1生物安全措施按照GB19489中的有关规定执行。7.2防污染措施防污染措施应符合GB/T27401的规定。DB34/T3283—20184AA附录A（规范性附录）副猪嗜血杆菌多位点序列分型的管家基因及引物序列表A.1副猪嗜血杆菌的管家基因基因名称片段大小bp管家基因名称atpD519ATP合成酶β链基因（βchainofATPsynthase）infB399翻译起始因子IF-2基因（translationinitiationfactorIF-2）mdh444苹果酸脱氢酶基因（malatedehydrogenasegene）rpoB330核糖体蛋白β亚基基因（ribosomalproteinβsubunit）6pgd4656-磷酸葡萄糖脱氢酶基因（6-phosphogluconatedehydrogenase）g3pd4413-磷酸甘油醛脱氢酶基因（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase）frdB453延胡索酸还原酶基因（fumaratereductaseB）表A.2副猪嗜血杆菌管家基因扩增（测序）的引物序列引物名称序列（5’→3’）atpD（Forward）atpD（Reverse）infB（Forward）infB（Reverse）mdh（Forward）mdh（Reverse）rpoB（Forward）rpoB（Reverse）6pgd（Forward）6pgd（Reverse）3gpd（Forward）3gpd（Reverse）frdB（Forward）frdB（Reverse）CAAGATGCAGTACCAAAAGTTTAGACCTTCATCACGGAATTTCTATATCCGTAAAGCGAAAGTACGACCTTTATCGAGGTAAGGCACTTTATGATATTGCCCCTTCCGTACCTGCATTTTGCTTCGGTTCATCACAACTTTCCGTCCATATAGTGAATTTCTTCAAACCACGCAAAGTGATGTCGTTGATCTTTGAATGAAGAGGTCAAGACATCGTTTCTAACTCTAATACTTTGTTTGAGTAACCAGGTTGGTCTTGCCGTATGGTTAGCACTTTCGATCTTACCTTDB34/T3283—20185BB附录B（规范性附录）系统遗传进化树的构建将所得到的副猪嗜血杆菌7个管家基因核酸扩增片段DNA序列进行MLST分析，获得菌株所对应的等位基因图谱，确定副猪嗜血杆菌分离株的序列型（SequenceType，ST），并与PubMLST数据库中国际菌株的资料进行比较。在确定STs的基础上应用eBURST程序将菌株分为各个谱系组（clonalcomplex），构建系统遗传进化树。图B.1为副猪嗜血杆菌进行MLST分析后绘制的系统遗传进化树图。图B.1副猪嗜血杆菌系统遗传进化树图_________________________________