层析技术基本原理

层析技术基本原理•层析术语•凝胶过滤层析•离子交换层析•疏水作用层析•亲和层析内容3/GE/层析（Chromatography）的历史1906-MikhailSemenovichTswett(1872-1919)植物色素分离:碳酸钙吸附剂/石油醚液体输送系统进样系统层析柱检测&自动收集系统4/GE/五大层析原理GelFiltration分子筛IonExchange离子交换Hydrophobicinteraction疏水层析Affinity亲和Reversedphase反相SOOO5/GE/重要的术语和参数•分离体积•分辨率•选择性•柱效•对称性•线性流速•载量6/GE/分离体积•Vo•VR•Vt•Vc•Vo=外水体积•VR=保留体积/洗脱体积•Vt=总液体体积•Vi=内孔体积/内水体积•Vc=柱体积•Vs=固相凝胶的体积7/GE/分辨率：分离峰的能力•10•20ml•0•200•400•ml•0凝胶过滤可得到15个峰反相液相峰150个注意：我们不是在纯化峰，而是纯化生物分子分离系数RsRs=4Rs=0.6Rs=1V2-V1(W1+W2)/2Rs=两峰相对于其峰宽而言,分开的有多远分辨率取决于选择性和有效性（柱效）高柱效低柱效有效性（柱效）:•峰宽的量度•柱效越高峰越窄•高柱效需要良好的柱填装技术•高柱效有时可弥补选择性不足选择性:•峰分离的量度•高选择性可以达到基线分离•高选择性可以弥补低的柱效-峰体积有可能增加低选择性高选择性流速大分子小分子峰宽峰展宽的影响因素流速峰宽大颗粒小颗粒流速峰宽填装差不规则填装好增加流速(轴向扩散）(传质阻力)降低流速(涡流扩散)不规则的填料涡流扩散填料粒径分布&柱装填质量流速对峰宽的影响峰宽流速涡流扩散轴向扩散传质阻力•H=Adp+B/u+Cdp2u层析速率方程H:等板高度,dp:粒径,u:linearflow线速度Adp:eddy,B/u:diffusionalongcolumn,Cdp2u:masstransfer柱效测定方法测试样品:1%柱体积丙酮（浓度1%）或者氯化钠VoVsVi对称性AsAs=1峰最好的形状As1峰拖尾As1峰前倾widthsat10%heightVrAU280baAs=baAS：0.8~1.5可接受的范围线性流速Flow(ml/min)x60CrossArea(cm)2线性流速(cm/hr)=流速(ml/min)柱高(cm)线性速度：流体前沿沿柱管单位时间向下的迁移距离(cm/hr)Flow流速MasstransferBeadssurface&innerpores填料表面和内孔Bulk溶液主体载量(吸附层析)载量取决于:蛋白性质-分子量,形状,带电性,疏水性等填料性质-性质,粒径大小,配基等操作条件-pH,盐浓度,添加剂,蛋白浓,温度,流速18/GE/•层析术语•凝胶过滤层析•离子交换层析•疏水作用层析•亲和层析内容19/GE/什么是凝胶过滤层析凝胶过滤层析：是根据分子的大小来分离生物分子的一种简单可靠的层析技术。•根据大小和形状分离•非吸附方式•只需一种缓冲液•容易操作20/GE/Agarose琼脂糖凝胶•孔内充满洗脱液•孔径精密控制•基架化学惰性，耐受常见溶剂•基架具有一定的机械强度•基架不能吸附生物分子•cross-linkedagarose•dextranCross-sectionfromSuperdexparticle凝胶过滤填料的结构作用原理1.装填在柱子里的球状填料.2.上样.3.缓冲液携带着样品通过层析柱，分子在填料孔径内来回扩散.4.大分子先流出层析柱，小分子后出.1432出峰顺序怎么去做----知道分子量大小和差异目的物和杂质分子量差别一倍以上•monomer•dimer•mAU•0•500•1000•1500•0.0•5.0•10.0•15.0•20.0•25.0•ml•Superdex™:首选的分子筛凝胶−选择性高,快速,可放大•Sephacryl™HR−规格齐全、经济有效聚集体去除,小规模•Superose™−分离范围广•Sepharose™−病毒/DNA/多糖等−大分子纯化•Sephadex™−快速脱盐，置换缓冲液，去除试剂怎么去做----选择合适填料怎么去做----选择合适填料怎么去做----选择合适的层析柱分辨率样品体积•µl•ml•Superdex10/300GL•HiPrep26/60Sephacryl•HiLoad26/600Superdexpg•Superdex™PC3.2/30•Superdex5/150GL•Superose™PC3.2/30•Superose10/300GL分析和微量制备型制备型•HiLoad™16/600Superdexpg•HiPrep™16/60Sephacryl™•Note:Deadvolumeinthesystemmustbeminimized!26/GE/主要应用•组分离−脱盐/交换缓冲液•精细分离−聚集体去除，分离不同大小分子量的蛋白•检测用途−计算分子量−纯度检测组分离----脱盐及缓冲液交换1020304050secHiTrap™Desalting2ml04681012albuminNaClDisposablePD-10DesaltingcolumnsHiPrep™26/10Desalting精细分离12timehIGF-1AU2800.10.05Column:HiLoad™16/600Superdex™75pgSample:IGF-1,ZZfusionproteinanduncleavedmaterialBuffer:0.15ammoniumacetate,pH6.0Flowrate:0.75ml/min22.5cm/h重组IGF-1纯化重组磷酸酶纯化Column:HiLoad16/600Superdex75pgSample:4mlconcentratedeluatefromaHICruncontainingrPhosphataseBuffer:25mMTris-HCl,0.3Msodiumchloride,1mMEDTA,2mMDTT,pH7.4Flowrate:0.5ml/min15cm/h检测----分子量测定估算分子量VRlogMrUNICORN分析软件（选配）自动计算手动绘制保留体积对分子量对数的校正曲线…检测----纯度测定U1464086Eluatdil10003:10_UV2_215nmU1464086Eluatdil10003:10_InjectU1464086Eluatdil10003:10_EditedBaseline02004006008001000mAU0.05.010.015.020.025.030.0mlAggregateU1464086Eluatdil10003:10_UV2_215nmU1464086Eluatdil10003:10_InjectU1464086Eluatdil10003:10_EditedBaseline0.05.010.015.020.025.0mAU10.012.014.016.0ml•抗体二聚体含量分析•头孢类青霉素聚合物含量分析31/GE/•层析术语•凝胶过滤层析•离子交换层析•疏水作用层析•亲和层析内容32/GE/什么是离子交换层析离子交换层析：是根据不同的生物分子所带的电荷性质差异来分离物质的一种层析方式。•吸附性层析•可逆的•可操控性好•浓缩33/GE/NH3RCOOH-RCOO-+RCOO+NH3NH2lowpH正电荷highpH负电荷获得氢失去氢离子交换作用原理----蛋白质的荷电性带电荷的表面•蛋白质的表面有带电荷的氨基酸•净电荷是正的或负的•净电荷随pH改变34/GE/overallchargeonprotein-+NH3RCOOH+NH3RCOO+-RNH2COO-酸等电点碱正电荷多正电荷=负电荷负电荷多蛋白质所带有的电荷取决于pHpH3pH10离子交换原理----蛋白质荷电滴定曲线35/GE/阴离子交换填料Diethylaminoethyl(DEAE)-OCH2CH2N+H(CH2CH3)2弱Quaternaryammonium(Q)-CH2N+(CH3)3强阳离子交换填料•Carboxymethyl(CM)-OCH2COO–弱•Sulphopropyl(SP)-CH2CH2CH2SO3–强•Methylsulphonate(S)-CH2SO3–强+---+++_-+-++-离子交换原理----离子交换填料36/GE/作用原理----正负电荷的相互作用怎么做离子交换层析选择离子交换填料选择缓冲液选择洗脱方式123选择离子交换填料阴离子交换填料–本身带正电荷结合阴离子–常见基团类型有Q，DEAE和ANX阳离子交换填料–本身带负电荷结合阳离子–常见基团有：S，SP和CM1+-+-_+-+•一般情况下:pI7阳离子交换pI7阴离子交换选择缓冲液及pH阴离子交换:•缓冲液的pH高于等电点0.5-1pH单位•pH越高结合越紧•考虑蛋白质的稳定范围(在pH=pI时通常不稳定)阳离子交换:•选择缓冲液的pH低于蛋白质的等电点0.5-1pH单位•pH越低结合越紧•考虑蛋白质的稳定范围(在pH=pI时通常不稳定)2选择洗脱液及洗脱方式首先尝试盐浓度梯度线性洗脱:(梯度越长分离效果越好)注意:不同的盐的类型洗脱强度是不同的:•Sulphate(SO4-2)150mM•Chloride(Cl-1)350mM•Acetate(CH3COO-1)700mM3分离再生重平衡平衡液A:20-50mM洗脱液B:20-50mM+1MNaCl0–50%Bin20colvol51–100%Bin3–5colvol100-0%Bin3–5colvol41/GE/线性梯度——预实验优化的步级梯度洗脱选择洗脱液及洗脱方式342/GE/上样和清洗洗脱平衡再生-----------------------------------------------------------++++++++++++++++++++++++++++++-----------阴离子交换介质离子交换的基本步骤离子交换的用途•离子交换适合于纯化的各个阶段：捕获、中度纯化、精细纯化•离子交换适合于不同大小规模的纯化：从研发到中试以及大规模工业化生产捕获原材料的初始纯化Column:Tricorn™5/100packedwithSPSepharose™FastFlowSample:Humanbloodplasmadiluted5timesSample:10CVStartbuffer:100mMaceticacid,50mMsodiumphosphate,20mMsodiumsuccinatepH5Elutionbuffer:100mMaceticacid,50mMsodiumphosphate,20mMsodiumsuccinate,1MNH4Cl,pH8Flow:0.96ml/min(300cm/h)Gradient:0–100%elutionbufferin20CV中度纯化进一步去除杂质IntermediatepurificationofrecombinantP.aeruginosaexotoxinAonSOURCE30Q.Column:SOURCE™30Q,FineLINE™100(375ml)Sample:PartiallypurifiedrecombinantP.aeruginosaexotoxinA,diluted1:3withwaterSample:1.8gtotalprotein(0.29gexotoxinA)in1.5lStartbuffer:20mMsodiumphosphate,pH7.4Elutionbuffer:20mMsodiumphosphate,1MNaCl,pH7.4Flow:785ml/min(600cm/h)Gradient:0–50%elutionbufferin20CVNativePAGEresults,Pha