蛋白酶的盐析沉淀实验报告

蛋白酶的盐析沉淀实验报告班级：生工1005学号：0203100520姓名：朱同辉实验目的：1.掌握使蛋白质胶体溶液保持稳定的因素；2.了解蛋白质沉淀的几种方法及其意义；3.掌握测定蛋白酶活力的原理和方法；4.学习酶活力的计算方法。实验原理：盐析法在蛋白质溶液中加入少量中性盐，蛋白质溶解度增加，称为盐溶；而加入大量中性盐达一定浓度，蛋白质就会沉淀，称为盐析。原理：①大量盐加入后，能与蛋白质争夺水分子，去除水膜；②大量盐能中和蛋白质分子表面电荷，使分子间静电斥力减弱，疏水作用增强，使蛋白质沉淀。盐析效果：二价离子一价离子离子半径小离子半径大阳离子∶Mg2+Ca2+Ba2+NH4+Na+K+Pb+Cs+阴离子∶PO43-SO42-Cl-Br-NO3-I-SCN-蛋白质的溶解度与盐离子强度间的关系可以用Cohn经验式来表示：式中：S—蛋白质的溶解度I—离子强度β—常数，与温度和pH有关Ks—盐析常数，与蛋白质和盐的种类有关其中I根据下式计算：式中：ci—i离子的浓度（mol/L）zi—i离子所带的电荷蛋白酶活力的测定福林（Folin）试剂在碱性条件下可被酪氨酸还原成兰色化合物，蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸，将产物中未被水解的酪蛋白除去后与福林试剂作用，根据显兰色的深浅可以计算出酪氨酸的产生量，从而推断酶活力的大小。蛋白酶液的稀释、酶活测定和计算K—在酪氨酸标准曲线上O.D值为l时酪氨酸的微克数（μg），K值为108.53680D.ONK104酶活力IKSlogs2iizc21IN—酶液稀释倍数4—酶反应液为4ml，取出1ml测定，故乘以410—反应时间为10min参考稀释倍数：原酶、饱和度20%，30%，40%，50%，60%，70%的上清液分别为1000，200，150，100，100，100，50倍实验步骤：1）蛋白质盐析分两个大组进行实验，每大组取6只烧杯编号，分别加入50ml蛋白酶液，分别称量5.70，8.80，12.16，15.66，19.5和23.6固体硫酸铵粉末（对应20%，30%，40%，50%，60%，70%饱和度），在磁力搅拌器不断搅拌下，将其缓慢加入酶液中，加完后再搅拌5min，使硫酸铵完全溶解。然后静置使蛋白酶沉淀完全。将含有沉淀的酶液小心倒入离心管中，在天平上称重平衡，用高速冷冻离心机离心于10℃，10,000r/min离心20min。将上层清液倒入量筒记录其体积，并分别测定酶活（u/ml），即为该酶的溶解度S。2）蛋白酶活力的测定：1.将2%酪蛋白溶液40℃预热3-5min2.取3支试管编号0、1、2，分别吸取待测酶液1ml放入试管中，40℃水浴中预热1-2min3.往0号试管加入0.4mol/L三氯醋酸2ml，再往3支试管中加入2%酪蛋白1ml，计时摇匀，40℃反应10min4.往1、2号试管中加入0.4mol/L三氯醋酸2ml，摇匀，取出3支试管静置10min5.另取3支试管，分别吸取上述清液1ml，各加入0.4mol/L碳酸钠溶液5ml，福林试剂1ml，于40℃水浴中保温20min显色。6.以0号管为对照，在波长680nm处测定1、2号管的吸光度，求出平均值。3）蛋白酶液的稀释、酶活测定和计算计算出各种硫酸铵饱和度下的硫酸铵浓度，离子强度，蛋白酶溶解度和上清液酶活残留，并填表。以logS为纵坐标，I为横坐标作图，将直线部分线性回归，求出Ks和β的数值，建立起蛋白酶的盐析曲线。数据记录及实验结果：编号O.D680平均值上清液体积/mL原酶液10.3880.406\20.424饱和度20%11.0691.12155.821.173饱和度30%10.8190.82155.420.823饱和度40%10.9520.98553.021.018饱和度50%10.0210.22056.220.418饱和度60%10.0620.05158.520.040饱和度70%10.0910.15162.120.211讨论：通过本次试验，初步掌握了蛋白酶盐析沉淀及其酶活测定的方法。在开始实验时，对实验的整体思路没有理解，仅仅盲目的按照步骤进行，导致浪费了很多时间，并且实验结果不理想。希望老师能在实验的前一周把讲义发给大家，进行充分的预习，对提高实验效率和准确度会有帮助。编号(NH4)2SO4浓度mol/L离子强度I上清液酶活蛋白酶溶解度SlogS原酶液00\\\饱和度20%0.822.464866271522.85.43饱和度30%1.233.697128394891.25.59饱和度40%1.644.926414339942.05.53饱和度50%2.056.1595553671.04.72饱和度60%2.467.3822112928.54.11饱和度70%2.878.6132820368.84.31