生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价的技术审评一般原则

[S]GPH3-1生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价技术审评一般原则药品审评中心二OO五年十二月目录一、概述......................................3(一)病毒安全性控制的迫切性...................3(二)病毒安全性技术审评基本内容和适用范围.....3二、病毒污染的来源和控制....................4(一)病毒污染的可能来源......................41细胞种子/动物组织原材料携带的病毒......42细胞培养增殖过程中引入的病毒..........4(二)病毒污染的控制和检测.....................51组织原材料和种子库细胞来源动物病毒感染方面的研究资料..........................52严格控制生产用生物组织原材料的来源动物.53严格生产用种子库细胞的病毒检测........64细胞培养结束时混悬液的病毒检测........65动物组织原材料匀浆的病毒检测...........7三、病毒检测方法..............................8(一)体外法...................................8(二)体内法...................................8(三)动物抗体产生试验.........................8(四)其他方法.................................8四、病毒去除/灭活验证研究及有效工艺步骤评价...8(一)病毒去除/灭活验证研究....................811目的和基本原则.........................92方法和要点.............................93指示病毒的选择........................104人员、设施............................11(二)病毒去除/灭活有效工艺步骤评价............111评价基本要点..........................112影响因素及综合分析....................12(三)统计处理分析.............................14五、病毒安全性追踪观查.......................15六、小结.....................................15七、名词解释.................................17八、参考文献.................................17九、附录.....................................182生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价技术审评一般原则一、概述（一）病毒安全性控制的迫切性随着动物源性组织、细胞、体液及重组真核细胞表达制备的生物制品逐渐增多，使用的人群不断扩大，加之动物源性产品原材料质量控制未引起足够重视，生产工艺又基本没有经过严格的病毒去除/灭活效果验证。因此，目前动物源性病毒感染人类的风险性极高，潜在医源性感染问题变的日益突出。其中动物组织来源制品由于动物本身健康检疫状况差，不同动物携带的病毒外源因子复杂多变，可控性因素尚不确定，对人体的潜在危害性较之经过系统鉴定和严格控制的真核细胞表达制品的风险性更高。根据《药品注册管理办法》的要求，由人的、动物的组织或者体液提取的制品、动物源性单克隆抗体及真核细胞表达的重组制品，尚需增加病毒灭活工艺验证资料。（二）病毒安全性技术审评基本内容和适用范围为了加强动物组织/细胞来源制品病毒安全性的质量控制，结合国家食品药品监督管理局已发布的《血液制品病毒去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》，参考其它相关的技术要求，我们制定了本技术审评一般原则，试用于重组或者杂交的动物真核细胞（例如重组CHO细胞、人/动物杂交瘤细胞等，但不包括酵母细胞）经培养后表达或者分泌，以及直接采用动物组织原材料（例如动物细胞、组织及体液等）经提取、纯化制备的治疗用生物制品。基本内容包括：31、生物组织来源动物的病毒控制，生物组织原材料及细胞种子库病毒筛查。2、细胞培养悬液及生物组织原材料匀浆中污染病毒的检测。3、病毒去除/灭活工艺验证研究及综合评价。4、病毒安全性追踪观察本技术审评一般原则仅重点考虑研究、生产和检定中的一般共性问题，不可能包纳和适用于各种复杂的实际情况。因此，在论证动物源性生物制品的病毒安全性方面应结合具体产品性质、特点，充分考虑特定品种的个性问题，突出和强调科学性。二、病毒污染的来源及控制（一）病毒污染的可能来源主要有二个途径：1、细胞种子/动物组织原材料携带的病毒通常细胞种子/动物组织原材料是病毒污染的源头。由于细胞和组织来源的动物种类不同，动物自然携带或者感染的病毒种类一般有所不同。另外，动物组织原材料在取材、运输及保存过程中如果不执行严格的操作规范，则有可能与其它动物组织感染的病毒形成交叉污染。鉴于动物病毒的来源、感染性质和风险性十分复杂，因此需要全面分析、综合考虑病毒污染的可能性，重点关注检测出的病毒对于人的致病性、感染性和复制活性。2、细胞培养增殖过程中引入的病毒动物组织原材料经常被制作成细胞培养需要的培养基、添加成分及辅料，如果这些原材料本身污染有病毒，在生产工艺过程中又未能进行有效控制，这些病毒将随细胞的连续培养得到复制扩增，4特别是生产人员在对培养细胞进行接触性操作中，如果没有严格执行GMP，则随时可能引入污染的病毒。（二）病毒污染的控制和检测病毒作为感染性因子，通常需要伴随细胞生存，其基本生物学特征表现为对活细胞的严格依赖性。动物作为活生命体，必然易成为病毒的自然宿主。因此无论是动物组织原材料匀浆、细胞培养结束时的混悬液，如果已知污染了对人致病或者感染性的野生外源病毒，则不能用于生产制品；如果检出了内源性逆转录病毒、具有种属特异性的其它感染性活病毒，在没有充分证据表明对于人体安全性和充分的灭活验证保证的前提下，须废弃该原材料并妥善处理。对于真核细胞的病毒检测应特别关注人/动物杂交瘤细胞。可选用人源、猴源细胞和生产用细胞系等适宜的盲传细胞，进行体外传代培养，使潜在病毒能够充分扩增显现。特殊情况下，还需要通过浓缩样本的方式进行动物传代试验及其它适宜的检测试验提高对轻微污染病毒的检出几率。具体内容包括如下五个方面：1、组织原材料和种子库细胞来源动物病毒感染方面的研究资料。应特别关注已确认对于人类具有感染和致病能力的病毒以及已有试验提示与人类疾病具有密切关联性的病毒。应明确生产用组织原材料和种子库细胞中可能存在的动物源性病毒的种类，包括种特异性病毒、逆转录病毒等。阐明风险性病毒对人的多种敏感细胞的亲嗜性、对不同动物宿主的感染适应性和选择特异性，提供有关生物学特性以及对理化因素敏感性等方面的研究报道资料。2、严格控制生产用生物组织原材料的来源动物5建立动物种群，采取封闭、隔离的饲养管理方式既是从生产源头严格控制生物组织原材料质量的重要组成部分，也是重要保证措施之一。动物必须经过符合兽医检验要求的健康状态监测并建立档案资料。应根据不同的动物种类和不同的病毒选取适用的病毒筛查方法例如PCR、ELISA等。充分考虑检测结果能够反映的动物病毒实际感染状态。根据相关研究资料确定检测的病毒种类，并提供选择的依据和理由。每批原材料投产前应进行相关病毒的复核检定。3、严格生产用种子库细胞的病毒检测对于直接引用已建立的传代细胞系（例如CHO细胞），应提供引进时的合法来源、传代历史及外源因子鉴定方面的证明性文件，在病毒的检测控制方面可参照《中华人民共和国药典》三部2005年版生物制品生产用动物细胞基质制备及检定规程中关于细胞内外源病毒因子检查的相关要求复核验证种子库细胞。对于新建立的细胞系，应按照建库细胞的要求严格筛查内源性病毒。根据来源的始祖细胞或者亲本细胞特点，充分考虑动物病毒方面已有的研究报道及其它适宜资料，设计病毒检测的项目和要求，完成系统全面的鉴定。因为一旦漏检，细胞内源性病毒将在实际生产中大量扩增，导致病毒的严重污染。4、细胞培养结束时混悬液的病毒检测如果种子细胞携带有未筛查出的病毒或者在培养过程中意外引入了污染的病毒，则随着细胞的扩增，潜在的病毒将会得到大量复制。因此，在确定了细胞培养的基本生产条件和工艺后，应将多批收获物（特指细胞培养结束时的混悬液），在未经任何处理前，对代表性样本进行适宜的病毒污染检测。得到的结果最能够反映培养细胞及其产物在生产过程中有无病毒污染及污染程度。如果混悬液6本身有细胞毒性，则应尽量抽取最初分离工艺处理后的样本，以降低细胞毒性。也可以根据具体情况，检测由培养过程中及终点时的完整或破碎细胞及其上清液组成的代表性样本。上述代表性样本是指：1）在模拟生产条件下，从至少三批培养细胞及其上清液制备的混悬液中抽取的样本。2）生产过程中不同阶段或者不同时间点采取的样本。3）抽取的样本量应能够反映培养物整体的情况。应有在模拟或者中试条件下至少三批上述样本的检测结果。如果在此阶段检出了外源污染的感染性活病毒，则必须废弃培养的细胞混悬液，认真查找原因并采取相应对策。在建立了生产规范，能够严格控制生产工艺过程后可以定期抽查培养终末时未处理的细胞培养物混悬液。5、动物组织原材料匀浆的病毒检测组织原材料经适宜的方法破碎处理后，细胞内的病毒将会释放到匀浆中，通过检测匀浆中的病毒，可以定量了解原材料中病毒的污染程度和负载量，为采取相应处理工艺提供基础研究数据。应在适宜的时间点（根据细胞破碎的程度）采集组织原材料匀浆样本，了解病毒释放的程度，防止未破碎细胞内或者黏附在破碎细胞残片上的病毒得不到充分的去除/灭活处理。综上，对于生物组织来源的病毒控制应充分考虑各种不确定隐匿病毒带来的风险性，重点结合第1、2、5条要求进行分析研究；对于真核细胞主要应考虑细胞培养对病毒的扩增作用和培养过程中的意外污染，重点结合第1、3、4条要求进行分析研究。但无论是7生物组织还是真核细胞的病毒控制均需要结合实际，在处理特殊情况时应对个例问题具体分析。三、病毒检测方法可以采用各种适宜的方法检测污染的病毒。下列方法仅供参考，应结合品种的特点和具体生产情况，综合分析后进行设计和选择，但应有合理的依据和支持性资料。（一）、体外法可采用不同种属的多种敏感细胞系进行共培养检测，在适宜的培养时间点取样检测感染性病毒。至少应盲传3代。（二）、体内法在没有可靠的体外试验方法时，可采用适宜动物进行接种盲传试验，采用敏感方法检测有无感染性病毒。（三）、动物抗体产生试验对于尚没有合适的体内和体外病毒检测方法时，可采用不同的动物，观察种特异病毒的抗体产生情况。抗体产生试验特别有助于检出啮齿类动物病毒。（四）、其他方法根据传代中可能发生的污染病毒进行选择性检测，例如电镜、ELISA、PCR方法、RT检测等。四、病毒去除/灭活验证研究及有效工艺步骤评价（一）病毒去除/灭活验证研究在进行验证研究时，应当采用高度敏感和特异的检测方法对纯化后的原液进行针对性检测，在临床研究之前应提供在合理的模拟生产工艺或者接近实际生产条件下对至少三批纯化原液的病毒检测8结果，以此排除可能污染的感染性活病毒，有效控制制品的病毒安全性。1、目的和基本原则验证研究的目的是为了获取充足的试验研究数据证明生产工艺是否包含有效的病毒去除/灭活工艺步骤。基本原则要求生产工艺必须包含病毒去除/灭活的有效工艺步骤。若无，应根据不同品种特点增加相应处理方法，并不得改变制品原有的质量。对于生物组织提取制品应包含两种从机制上能够互补的有效工艺步骤，至少一个处理步骤应具有针对非脂包膜病毒的去除和/或灭活效应；对于真核细胞表达制品应至少包含一个有效工艺步骤，并能够有效去除和/或灭活非脂包膜病毒。关于有效的病毒去除/灭活技术方法，参见《血液制品病毒去除/灭活病毒技术方法