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5蛋白质定性定量分析及保存蛋白质定性分析(qualitativeanalysis)确定样品中是否有蛋白质存在，以及存在的是何种蛋白质蛋白质定量分析(quantitativeanalysis)确定样品中总蛋白含量，或者某种单一蛋白成分的含量蛋白质含量的测定方法蛋白质相对分子量测定纯化蛋白质的浓缩、干燥和保存蛋白质的免疫印迹分析(westernblotting)蛋白质组学定量研究常见方法第一节蛋白质的含量测定•目前蛋白质的直接定量分析技术只能测定样品的总蛋白含量；目前没有任何方法能直接分析样品中某一特定蛋白成分的含量；•最常用的蛋白定量方法是比色法，包括Bradford（考马斯亮蓝）、BCA法、紫外分光光度法等。蛋白质的比色法含量测定基于蛋白质的元素组成特点基于蛋白质的化学显色反应基于蛋白质的光吸收特性一、基于蛋白质元素组成的特点----凯氏定氮法各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16％由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量：100克样品中蛋白质的含量(g%)=每克样品含氮克数×6.25×100凯氏定氮法1883年，丹麦化学家Kjeldahl建立，基于蛋白质的含氮量在16%左右。蛋白质+硫酸→CO2+H2O+NH3→硫酸铵+强碱→氨优点：适用样品广泛，结果可靠缺点：样品中非蛋白态氨影响测定值；蛋白质氨基酸有偏差时（大量碱性氨基酸、酰胺、小分子量氨基酸）误差较大；操作繁琐。二、基于蛋白质的光吸收特性------紫外光谱(A280)吸收法这一方法可用来快速检测溶液中是否含有蛋白质成分。通常用于柱层析过程中检测蛋白质的洗脱峰。原理芳香族氨基酸的紫外吸收蛋白质中的Trp、Tyr在280nm有特征性吸收；肽键在215nm附近有特异吸收。可通过测定该波长的光吸收度，计算蛋白质浓度。C＝A/KL，其中A为吸光度，K为摩尔消光系数，L为光程。K值可通过各种方法得到（包括软件分析等）。所需时间•几分钟优点•快速缺点•核酸可引起强干扰作用灵敏度•0.2mg/ml～2mg/ml•对蛋白质无破坏性•不是严格的定量，适用于测定蛋白质粗提液计算方法•标准曲线法•蛋白质浓度(mg/ml)=1.45×A280-0.74×A260注意事项•石英比色杯•调零所用溶液•配制标准蛋白所用溶液•光密度范围二、Bradford检测法由Bradford等人于1976年建立这是一种迅速、可靠的通过染色法测定溶液中蛋白质含量的方法目前绝大多数公司都提供基于此原理的蛋白质定量试剂盒基于蛋白质的化学显色反应原理该法是基于考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式。在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳。蓝色复合物在595mn波长处具有最大光吸收值，并与溶液中蛋白质浓度成正比，因此可检测595mn的光吸收值大小计算蛋白的含量所需时间•10min优点•快速（反应时间仅需2min）•敏感，几乎没有蛋白质损失缺点•用这种测定方法对蛋白质引起不可逆的变性灵敏度•25ug/ml～200ug/ml•对各种纯化蛋白质反应不同计算方法•标准曲线法注意事项•标准曲线在2.5ug～15ugBSA浓度范围内保持线性关系•反应10～15min后开始出现沉淀，尤其是高浓度蛋白质溶液在酸性条件下易发生沉淀•若选用目的蛋白来做标准曲线或用另一种方法来校正，所测蛋白浓度较准确三、Lowry检测法1951年Lowry在Folin酚试剂法和双缩脲法的基础上建立这一标准、快速的蛋白质定量检测方法已得到广泛应用，在检测之前可通过蛋白质沉淀将干扰物质去除基于蛋白质的化学显色反应原理首先在碱性溶液中形成铜-蛋白复合物，然后这一复合物还原磷钼酸-磷钨酸试剂(Folin-酚试剂)，产生钼蓝和钨蓝复合物的深蓝色，这种深蓝色的复合物在745～750nm处有最大的吸收峰，颜色的深浅(吸收值)与蛋白质浓度成正比，可根据750nm的光吸收值大小计算蛋白质的含量所需时间•40min优点•一种可靠的蛋白质定量方法•不同蛋白质之间差别很小缺点•某些试剂不稳定灵敏度•5ug/ml～100ug/ml•干扰物质多•反应速度慢•使蛋白质发生不可逆变性计算方法•标准曲线法注意事项•在加入试剂30min后呈色达到饱和，时间延长颜色信号减弱•许多干扰物质降低颜色反应•高盐浓度可引起沉淀四、BCA(二喹啉甲酸)检测法这是近年来新研制的一种改进的Lowry测定法，反应简单而且几乎没有干扰物质的影响，有试剂盒出售。基于蛋白质的化学显色反应原理在碱性环境下蛋白质分子中的肽键能与Cu2＋生成络合物，同时将Cu2＋还原成Cu＋。而BCA试剂可敏感特异地与Cu＋结合，形成稳定的有颜色的复合物，在562nm处有高的光吸收值。颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，可根据吸收值的大小来计算蛋白质的含量。优点•与Lowry法相比几乎没有干扰物质的影响缺点•蛋白质发生不可逆的变性灵敏度•标准检测：10～1200ug/ml•单一试剂•终产物稳定•反应时间长•微量检测：0.5～10ug/ml计算方法•标准曲线法注意事项•与Lowry相比，采用BCA法时，如果样品中含有脂类物质将明显提高光吸收值•为促进BCA法的反应进程，可将样品适当加热其它蛋白质的定性定量方法1.蛋白质的染色定量2.ELISA测定3.放射免疫测定第二节蛋白质相对分子量测定分子量测定(molecularweight,MW)排阻层析沉降平衡超速离心动态弹性光散射孔径梯度电泳质谱(ESI-MS)1.SDS-PAGE测定分子量基本原理：SDS可以破坏蛋白质中的疏水键和氢键，并按一定比例（1g蛋白质结合1.4gSDS）和蛋白质组成复合物，使蛋白质带的负电荷的量远远超过其本身的电荷量，并与蛋白质的分子量成正比。2-巯基乙醇破坏了蛋白质二硫键，使蛋白质呈椭圆棒形，其轴长与分子量成正比。＝q/f＝q/6r，所有蛋白质的迁移率都相同。在SDS-PAGE中迁移的蛋白质的分子量与电泳迁移率的关系符合下述公式：lgMr＝lgK－bm＝K1－bm其中Mr为蛋白质相对分子量，K、K1为常数，b为斜率，m为迁移率。注意：此公式也适用于核酸在琼脂糖凝胶中的迁移在半对数坐标纸上做出标准曲线注意：标准曲线的斜率会根据所用凝胶浓度而发生微小的改变。2.凝胶过滤层析法测定分子量蛋白质在凝胶过滤层析柱中的洗脱体积Ve，与其分子量的关系如下式所示：lgMr＝K1－K2Ve在实验中，只要测得几种蛋白质分子量标准物的Ve，并以它们的lgMr对Ve作图得一直线，再测出样品的Ve，即可从图中得到样品的分子量。SDS-PAGE与凝胶过滤法是互补的凝胶过滤法测得的是蛋白质四级结构（如果它有的话）的分子量；SDS-PAGE测得的是蛋白质亚基的分子量；在有2-巯基乙醇（或DTT）存在时，SDS-PAGE可测得蛋白质每条多肽链的分子量。综合应用这两种方法，可得到待测蛋白质结构的许多信息。例如：凝胶过滤法得到的蛋白质分子量：180kDSDS-PAGE（不加还原剂）结果：45kDSDS-PAGE（加还原剂）结果：两条蛋白带（15kD和30kD）则结论是：该蛋白质由4个相同的亚基组成，每个亚基由两条多肽链经二硫键连接而成，两条多肽链的分子量分别为15kD和30kD。3.质谱法是最精确的分子量测定方法质谱（MassSpectrometry，MS）是带电原子、分子或分子碎片按质荷比（m/z）的大小顺序排列的图谱。由于ESI和MALDI两大电离技术的出现，质谱技术已广泛应用于蛋白质研究领域，包括蛋白质分子量测定。精确度0.01～0.1％。第三节纯化蛋白质的浓缩、干燥和保存一、蛋白质的浓缩1.超滤法使用特制薄膜对溶液中的溶质分子进行选择性过滤的技术。常用离心力使蛋白质透过滤膜，而使蛋白质截留在膜内。2.冷冻干燥法在冷冻状态下使样品中水分升华而浓缩蛋白质的技术，保持蛋白质构象的最好方法。注意：必须保证蛋白质始终处于冷冻状态（在－70℃冰箱预冷），为提高溶解度可加赋形剂（右旋糖酐、甘露醇等）。3.吸收法采用吸水剂直接吸去蛋白质溶液中的水。PEG、蔗糖、凝胶干粉等。4.沉淀法硫酸铵、PEG、有机溶剂沉淀；免疫沉淀。5.其它方法浓缩胶浓缩法离子交换法吸附法蒸发法二、蛋白质的干燥常压吸收干燥真空干燥冷冻干燥喷雾干燥气流干燥三、蛋白质的保存1.影响蛋白质成品保存的因素：1）空气2）湿度3）水分4）光线5）pH值6）时间2.蛋白质的保存方法低温下保存制成干粉或结晶保存在保护剂下保存a.惰性的生化或有机物b.中性盐c.巯基试剂第四节蛋白质组学定量研究常见方法蛋白质组学定量研究常见方法1：常规双向电泳2：DIGE3：15N等同位素标记4：ICAT5：iTRAQ6：SILAC1：双向电泳基于2D-PAGE的经典定量分析方法。1、样品准备和定量：抽提对照组和各种不同实验组的蛋白质。2、蛋白质分离：蛋白质经过2D-PAGE分离后染色（银染、考染等）。3、蛋白质的定性与定量分析：通过与对照组相ImageMaster7.0分析出实验组中差异点，质谱鉴定差异点蛋白质,同时应用软件分析出其表达量的变化。2：DIGE简介：DIGE—双向荧光差异凝胶电泳，利用荧光染料（Cy2,Cy3,Cy5）能与蛋白质赖氨酸的氨基反应而使蛋白质被标记，标记后蛋白质的等电点和分子量基本不受影响，等量混合标记好的蛋白质后进行双向电泳，蛋白质表达量的变化则通过不同荧光的强度来体现。技术优势：1：高效性，同一块凝胶上可以电泳两个样品，减轻了工作量；2：与常规银染相比灵敏度更高；3：检测动态范围更大；4：定量精确,采用内标而消除了胶与胶之间的实验误差；5：统计学分析，ImageMaster7.0（DIGE）软件可以得到统计学可信的结果，降低了操作者之间的偏差。2：DIGEDIGE荧光定量方法流程图.1、样品准备：提取对照组和不同实验组的蛋白质,定量,cy3和cy5交叉标记，同时将所有实验组与对照组的样品等量混合后cy2标记，作为内标。2、蛋白质分离：等量混合三种荧光素标记后的蛋白质，2D-PAGE电泳分离，荧光显色。3、蛋白质定量分析：ImageMaster7.0（DIGE)分析同一蛋白质不同处理后的表达量变化。3：代谢标记法—15N标记法简介：在培养基中添加15N，细胞经过若干代培养后，蛋白质将完全被同位素标记，等量混合标记与没有标记同位素的样本、液相色谱和SDS-PAGE分离，质谱鉴定和定量。根据质谱谱图中成对峰的面积之比可判断出同一肽段在不同样品中的含量变化，根据二级谱图对肽段进行序列测定从而鉴定蛋白质。优点：高效性：15N标记法是体内标记技术，标记效率可高达95%；重现性：降低由于样品制备不同而造成的实验内差异；灵活性：在培养基中添加同位素标记15N，操作方便。缺点：（1）只有已知蛋白质的氨基酸序列，才可以对14N/15N标记的蛋白质或肽段的相应质量位移进行预测。（2）由于使用的15N培养基纯度96%，无法完全置换14N,所以15N标记的肽段在质谱中会有额外的同位素峰。4：化学标记法—ICATA:ICAT试剂结构，包括3个部分，SH反应集团，biotin标签，同位素臂，试剂具有两种形式：重型（含8个氘）和轻型（不含氘）B:ICAT标记定量技术流程，来源不同处理的蛋白质分别用重型ICAT试剂和轻型ICAT试剂标记，标记后等量混合，胰蛋白酶酶切，亲和纯化得到ICAT标记的多肽，质谱分析，依据MS质谱峰图强度进行定量，MS/MS鉴定肽段。4：化学标记法—ICATICAT法的缺点：（1）它不能用于标记不含半胱氨酸或半胱氨酸含量低的蛋白质。（2）ICAT分子量相对较大（约500Da），与蛋白质连接后可能会造成分子的空间位阻（3）ICAT分子量相对较大（约500Da），由于在MS分析中标签仍保留在每个肽上，使得在碰撞诱导解吸（CID)条件下，很容易被片段化，那么标签特异化的片段离子就会使串联质谱分析标记肽段的过程复杂化，（4）ICAT分