基因工程的原理和技术

DNAlinking-enzymerestrictionendonucleaseDNAlinking-enzyme利用基因工程原理让大肠杆菌生产人胰岛素又需要哪些基本操作步骤呢？第二节基因工程的原理和技术基因工程（将人胰岛素基因转入大肠杆菌）胰岛素基因人体细胞大肠杆菌随细菌的增殖，胰岛素基因也同时复制胰岛素获取胰岛素基因的表达产物－胰岛素质粒大肠杆菌形成重组DNA分子导入受体细胞目的基因检测与鉴定获取目的基因剪切拼接导入表达（一）获得目的基因（二）形成重组DNA分子（三）将重组DNA分子导入受体细胞（四）目的基因的检测和表达基因工程的基本操作步骤（技术）1、筛选含有目的基因的受体细胞2、目的基因的表达问题：获取目的基因的方法有哪些？思考1：如果我们对目的基因的碱基序列完全未知，比如:如果我们对抗虫基因的碱基序列完全不知道，怎样从苏云金芽孢杆菌体内获取目的基因（抗虫基因）？如何操作？大片段DNA打成许多小片段小片段DNA目的基因载入运载体细菌重组DNA分子重组DNA分子例如：从苏云金芽孢杆菌中提取抗虫蛋白的基因如果运气不好，在打成小片段时，有可能把抗虫基因打断……基因组文库如何从基因文库中获取目的基因?大片段DNA打成许多小片段小片段DNA目的基因载入运载体细菌重组DNA分子重组DNA分子基因组文库对基因组文库的所有细菌进行逐一筛查找出有抗虫蛋白的菌落该菌落所携带的基因片段就含有目的基因例如：从苏云金芽孢杆菌中提取抗虫蛋白的基因容易吗？构建基因组文库，获取目的基因一.基因工程的基本操作步骤（技术）(一)获得目的基因生物材料DNA提取限制酶DNA片段形成重组DNA分子导入受体菌群体构建基因组文库1.从基因文库中获取思考：从基因组文库中获取人的胰岛素基因，导入大肠杆菌能否成功表达？为什么？思考：能否根据mRNA合成没有内含子的胰岛素基因？单链RNA（mRNA)逆转录酶杂交双链核酸酶H单链DNADNA聚合酶双链DNA逆（反）转录法合成目的基因：cDNA文库的构建RNA链DNA链水解RNA一.基因工程的基本操作步骤（技术）(一)获得目的基因生物材料DNA提取限制酶DNA片段形成重组DNA分子导入受体菌群体构建基因组文库mRNA逆(反）转录目的基因(cDNA)形成重组DNA分子导入受体菌群体构建cDNA文库1.从基因文库中获取提取思考：基因文库如同国家图书馆，而cDNA文库则像某单位的图书馆，二者除了大小不同之外，还有哪些区别？文库类型cDNA文库基因组文库文库大小基因中启动子基因中终止子基因多少小大无有无有部分基因全部基因思考：如果想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，需要构建哪一种基因文库？问题：获取目的基因的方法有哪些？思考1：如果我们对目的基因的碱基序列完全未知，怎样办？如何操作？思考2：如果我们已知目的基因的碱基序列，可以怎样操作？一.基因工程的基本操作步骤（技术）(一)获得目的基因生物材料DNA提取限制酶DNA片段导入受体菌群体构建基因组文库mRNA反转录目的基因(cDNA)导入受体菌群体构建cDNA文库目的基因的核苷酸序列是已知化学合成法目的基因1.从基因文库中获取2.化学合成法提取形成重组DNA分子形成重组DNA分子问题：获取目的基因的方法有哪些？思考1：如果我们对目的基因的碱基序列完全未知，怎样办？如何操作？思考2：如果我们已知目的基因的碱基序列，可以怎样操作？思考3：如果我们已知蛋白质的氨基酸序列，又可以怎样操作？思考：能否根据氨基酸的序列获得人胰岛素基因的碱基序列？化学合成法一.基因工程的基本操作步骤（技术）(一)获得目的基因生物材料DNA提取限制酶DNA片段形成重组DNA分子导入受体菌群体构建基因组文库mRNA反转录目的基因(cDNA)形成重组DNA分子导入受体菌群体构建cDNA文库目的基因的核苷酸序列是已知化学合成法目的基因1.从基因文库中获取2.化学合成法提取或可推测的问题：获取目的基因的方法有哪些？思考1：如果我们对目的基因的碱基序列完全未知，怎样办？如何操作？思考2：如果我们已知目的基因的碱基序列，可以怎样操作？思考3：如果我们已知蛋白质的氨基酸序列，又可以怎样操作？思考4：如果我们知道目的基因两端的部分碱基序列，还可以怎样操作？聚合酶链式反应（PCR技术）变性：双链DNA解链成为单链DNA复性（退火）：部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合延伸：以目的基因为模板，合成互补的新DNA链双链DNA1.变性升温至95℃单链DNA2.复性降温至60℃引物与母链结合3.延伸升温至72℃DNA聚合酶解旋PCR技术与原理TaqDNA聚合酶有耐高温的特点思考：PCR技术扩增目的基因，需要什么前提和条件？过程如何？原理是什么？聚合酶链式反应(PCR技术)扩增原理：目的：前提：条件：DNA复制获得大量的目的基因有一段已知目的基因（两端）的核苷酸序列,以便根据这一序列合成引物。模板DNA（目的基因）耐高温DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)四种脱氧核苷酸两种DNA引物一.基因工程的基本操作步骤（技术）(一)获得目的基因生物材料DNA提取限制酶DNA片段形成重组DNA分子导入受体菌群体构建基因组文库mRNA反转录目的基因(cDNA)形成重组DNA分子导入受体菌群体构建cDNA文库目的基因的核苷酸序列是已知化学合成法3.利用PCR技术扩增目的基因1.从基因文库中获取2.化学合成法提取获取大量目的基因或可推测的第一个循环第二个循环第三个循环最快第几轮能得到目的基因？体内DNA复制体外PCR扩增模板解旋引物酶DNA分子目的基因解旋酶高温（加热至95℃）RNA引物DNA引物解旋酶、DNA聚合酶等TaqDNA聚合酶•人工基因合成法DNA合成仪PCR扩增仪一.基因工程的基本操作步骤（技术）(一)获得目的基因•问题：怎样将目的基因与质粒进行重组？质粒目的基因限制酶DNA连接酶重组DNA同一种限制酶切割质粒外源基因重组DNA分子（重组质粒）DNA连接酶问题2：形成的重组质粒导入受体细胞后，除了能够稳定存在外，并且可以遗传给下一代。同时，使目的基因在受体细胞中表达和发挥作用，需要对重组质粒作怎样的修饰？•据图回答：一个表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有哪些基本元件？(二)形成重组DNA分子（构建基因表达载体)基因表达载体的组成启动子目的基因终止子复制起点标记基因一.基因工程的基本操作步骤（技术）(一)获得目的基因通常用同一种限制酶切割目的基因和载体(质粒)，形成相同的粘性末端，再用DNA连接酶将二者连接,形成重组DNA分子（基因表达载体）。用BamHⅠ对胰岛素基因和质粒切割，加入DNA连接酶，得到的都是重组质粒吗？含目的基因的DNA片段载体BamHⅠBamHⅠDNA连接酶重组体载体自连目的基因自连双酶切连接：思考：如何避免质粒和目的基因的自身环化？1、避免载体和目的基因的自身环化、载体和目的基因间反向连接2、提高重组DNA分子的重组率(三)将目的基因导入受体细胞(二)形成重组DNA分子（构建基因表达载体)一.基因工程的基本操作步骤（技术）(一)获得目的基因•常用的受体细胞：有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。重组质粒大肠杆菌的拟核目的基因氨苄青霉素抗性基因（标记基因）将细菌用CaCl2处理，使细胞处于感受态，可促进细胞吸收DNA分子如果是导入微生物（如细菌）感受态：细胞处于容易吸收外源性DNA的状态。处于感受态的细胞称为感受态细胞.CaCl20℃重组载体感受态细胞42℃如果是导入微生物（如细菌）(三)目的基因导入受体细胞1.转基因微生物重组DNA分子(基因表达载体)CaCl2处理感受态细菌细胞(工程菌)目的基因随受体细胞的繁殖而复制增大细胞壁通透性(二)形成重组DNA分子（构建基因表达载体)一.基因工程的基本操作步骤（技术）(一)获得目的基因吸收DNA分子重组DNA进入细菌细胞如果是导入动物细胞显微注射仪受精卵思考：培育转基因动物时，受体细胞能否采用动物体细胞？试说明理由。一般可以采用动物的什么细胞？用口径为1μm的DNA注射器，将大量的目的基因片段注入到受精卵的核内，然后把经过注射的受精卵移植到另一只雌性动物的子宫内，使受精卵发育为转基因动物。(三)目的基因导入受体细胞1.转基因微生物重组DNA分子(基因表达载体)CaCl2处理感受态细菌细胞(工程菌)目的基因随受体细胞的繁殖而复制增大细胞壁透性2.转基因动物重组DNA分子显微注射受精卵或早期胚胎细胞(整合到染色体DNA上)转基因动物动物细胞培养胚胎移植(二)形成重组DNA分子（构建基因表达载体)一.基因工程的基本操作步骤（技术）(一)获得目的基因吸收DNA分子重组DNA进入细菌细胞或病毒侵染思考：1、如果是导入植物细胞，最好以什么细胞为受体细胞？一般采用的运载体又是什么？2、比如：培育抗虫棉，怎样操作才能成功导入？农杆菌转化法农杆菌的Ti质粒T-DNA：(可转移的DNA）可转移（也可以将目的基因转移）至受体细胞中，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。农杆菌转化法3.转基因植物重组DNA分子农杆菌植物体细胞(整合到细胞染色体DNA上)侵染植物组织培养转基因植物农杆菌转化法利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒（有钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般在0.6～4um）表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。这是单子叶植物中常用的一种基因转化方法，但是成本太高。基因枪花粉管卵细胞花粉管通道法受精后花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。3.转基因植物重组DNA分子农杆菌植物体细胞(整合到细胞染色体DNA上)侵染植物组织培养转基因植物基因枪或花粉管通道法农杆菌转化法(三)目的基因导入受体细胞(二)形成重组DNA分子（构建基因表达载体)一.基因工程的基本操作步骤（技术）(一)获得目的基因(四)目的基因的检测与鉴定•问题1：根据中心法则，目的基因怎样表达？成功表达的标志是什么？按照基因表达顺序逐步检测，逐步过关检测转基因生物体内是否已含有目的基因检测目的基因是否已转录出了mRNA检测目的基因是否已翻译出了蛋白质检测个体是否具有目的基因所对应表现型如何检测？思考：通常为什么要选用含有两个标记基因的运载体？没有质粒含目的基因的质粒正常质粒没有质粒含目的基因的质粒正常质粒DNA分子杂交法检测目的基因DNA分子杂交法制作方法：化学合成或PCR法合成特点：1.被放射性同位素标记2.目的基因片段3.单链DNA原理：碱基互补配对，检测未知DNA分子用途：目的基因检测,DNA指纹,亲缘关系测定,基因诊断。DNA分子探针法检测转基因生物体内是否已含有目的基因同理：核酸分子杂交技术按照基因表达顺序逐步检测，逐步过关思考：受体细胞摄入目的基因后就说明目的基因完成了表达吗？检测目的基因是否已转录出了mRNA检测转基因生物体内是否已含有目的基因检测目的基因是否已转录出了mRNA检测目的基因是否已翻译出了蛋白质利用抗原--抗体的特异性结合按照基因表达顺序逐步检测，逐步过关问题：如何运用抗原抗体特异性结合的原理检测目的基因是否翻译出了蛋白质？检测目的基因是否已翻译出了蛋白质利用抗原--抗体的特异性结合将目的基因表达出的蛋白质作为抗原制备抗体检测转基因生物体内是否已含有目的基因检测目的基因是否已转录出了mRNA检测目的基因是否已翻译出了蛋白质检测个体是否具有目的基因所对应表现型按照基因表达顺序逐步检测，逐步过关问题：除了上述分子检测外，你能否在个体生物学水平上进行检测？例如，如何检测转基因抗虫棉具有抗虫特性？转基因抗虫植物用棉花叶片饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。(四)目的基因的检测与鉴定1.目的基因是否导入：(1)标记基因检测法。(2)DNA分子杂交法(DNA探针检测法)2.目的基因是否表达：(3)是否出现目的基因所控制的性状:(2)是