多聚酶链式反应扩增DNA片段-总结

多聚酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR技术)，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为DNA体外扩增技术。温故知新1:组成DNA分子的基本单位是什么?这些基本单位是如何连接成DNA分子的?DNA分子结构有什么特点？12345DNA的基本单位－脱氧核苷酸OOPOHO碱基OOHOOPOHOOH碱基碱基脱氧核糖磷酸基团碱基脱氧核糖碱基脱氧核糖5’3’脱氧核苷酸链结构简图磷酸二酯键ATGCAGCTDNA分子的平面结构氢键5'端3'端5'端3'端DNA分子的复制过程是怎样的？DNA分子的复制需要哪些条件？温故知新2DNA母链：提供复制的模板解旋酶：打开DNA双链4种脱氧核苷酸：合成子链的原料DNA聚合酶：催化合成DNA子链ATP：为复制过程提供能量引物：使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸DNA复制的条件复制特点半保留复制，边解旋边复制，多起点复制。DNA复制的方向DNA的合成方向总是从子链的5’端向3’端延伸1、DNA聚合酶特性不能从头合成DNA，只能从DNA的3′端开始延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物2、DNA聚合酶作用过程当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸一、基础知识（一）PCR原理：①在80～100℃的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性3、PCR原理②当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链③PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNA聚合酶失活的问题，耐高温的TaqDNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化4、TaqDNA聚合酶的应用5、缓冲液需要为PCR反应提供的物质DNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的DNA聚合酶，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出6、PCR技术的特点①PCR过程需要的引物是RNA或DNA，而是人工合成的DNA单链，其长度通常为20－30个脱氧核苷酸7、细胞内复制和PCR不同点②PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的细胞内DNA的复制PCR不同点解旋解旋酶，边解旋边复制80～100℃高温解旋，双链完全分开酶DNA解旋酶，DNA聚合酶，DNA连接酶TaqDNA聚合酶引物RNADNA或RNA能量ATP不加温度体内温和条件高温子链合成一条链连续（先导链），另一条链不连续，先合成片段，再由DNA连接酶连接（滞后链）两条子链均连续合成相同点①需要提供DNA复制模板②四种脱氧核苷酸作为原料③子链延伸的方向都是从5’端到3’端细胞内DNA的复制与PCR的比较PCR技术的原理总结利用DNA分子的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解旋与结合，从而完成体外DNA分子的扩增。体外DNA复制的条件：四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、引物、模板；缓冲溶液和严格控制温度的温控设备。复制的方向：子链的5’端向3’端延伸。（二）PCR的反应过程1、PCR的反应步骤PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤──变性、复性和延伸①变性（模板DNA解旋）模板DNA经加热至900C以上。一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备2、循环过程靶序列靶序列PCR循环第一步：加热变性②复性（退火）模板DNA经加热变性成单链后，温度降到500C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合PCR循环第二步：引物与靶序列退火③延伸DNA模板－引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的DNA链PCR循环第三步：引物延伸第1个PCR循环完成后：得到两个拷贝的靶序列3、30次循环后靶序列扩增的数量循环次数DNA数量122438201,048,576301,073,741,824二、PCR的反应过程小结5/3/3/5/5/3/引物Ⅰ5/3/引物Ⅱ变性95oC复性55oC延伸72oC5/3/3/5/5引物15引物2第二次复制第一次复制555555模板DNA5555555525～30次循环（复制）后，模板DNA的含量可以扩大100万（220）倍以上。每个循环包括：变性——复性——延伸从第二轮循环开始，上一次循环的产物也可以作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。PCR的反应过程：PCR反应条件：①稳定的缓冲液环境②DNA模板③分别与两条模板链相结合的两种引物④A、T、G、C四种脱氧核苷酸⑤耐热的DNA聚合酶，一般用TaqDNA聚合酶⑥能严格控制温度变化的温控设备三、PCR的实验操作1、PCR仪（一）设备及用具实质上一台能够自动调控温度的仪器2、微量离心管一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml3、微量移液器用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次PCR仪微量离心管微量移液器1、准备2、移液（二）实验操作步骤按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂①过程：盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁。②注意：3、混合B、手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的是使反应液混合均匀。A、离心管口的盖子一定盖严，防止实验中脱落或液体外溢。将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序。①过程：将微量离心管放在离心机上,离心约10s。4、离心5、反应②离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果。PCR三步曲预变性保温变性94℃30s延伸72℃1min复性55℃30s94℃5min循环数变性复性延伸预变性94℃，5min－－30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次94℃，1min55℃，30s72℃，1minPCR技术高度灵敏，为了避免外源DNA等因素的污染而造成干扰实验，PCR操作时要注意做到：6、注意事项①隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；②PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头（一）理论上DNA扩增数目的计算四、课题成果评价1、一条DNA，复制n次，DNA为2n2、a条DNA，复制n次，DNA为ax2n（二）实验中DNA含量的测定1、原理可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关稀释2μLPCR反应液，加入98L蒸馏水，即将样品进行50倍稀释对照调零以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零测定取DNA稀释液100μL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值计算DNA含量（g/ml）＝50×(260nm的读数）×稀释倍数2.过程比色杯五、实验小结PCR仪加热使（）变性,复性使引物与模板DNA（）,延伸需将反应温度升至中温(),在（）的作用下,以（）为原料,以（）为复制的起点,合成新链。如此重复改变反应温度,经（）三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。模板互补Taq聚合酶四种脱氧核苷酸引物变性、复性和延伸72℃1.提示：绘图可参考教科书中图5-9。PCR反应中的目的片段一般以2n的方式积累，其中n为反应循环次数。一个DNA片段在30次循环后反应物中大约有10亿个这样的片段（2n=230=1073741824)。2.提示：PCR引物是根据需要扩增的目标DNA的碱基序列来设计的。引物的设计需要丰富的分子生物学实验经验，感兴趣的学生可以参考《分子克隆实验指南》（见本专题参考书目），书中有详尽的论述。课后题: