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第2课时动物细胞融合技术与单克隆抗体课标内容要求1.阐明动物细胞融合是指通过物理、化学或生物学等手段，使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。2．概述细胞融合技术是单克隆抗体制备的重要技术。核心素养对接1.生命观念：以细胞结构与功能为基础，理解动物细胞融合的内涵。2．科学思维：结合具体实例，以流程图的形式表示单克隆抗体的制备过程。3．社会责任：说明单克隆抗体的特点及应用。自主学习一、动物细胞融合技术1．概念使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。2．诱导原理和结果(1)诱导原理：细胞膜的流动性。(2)诱导结果：形成杂交细胞。3．诱导方法：PEG融合法、电融合法和灭活病毒诱导法等。4．意义：突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。5．动物细胞融合技术的应用(1)成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。(2)用于制备单克隆抗体。二、单克隆抗体1．制备原理(1)B淋巴细胞特点：一种B淋巴细胞分泌一种特异性抗体。(2)骨髓瘤细胞特点：能在体外大量增殖。(3)杂交瘤细胞特点：B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合得到的杂交瘤细胞，既能无限增殖又能产生大量特定抗体。2．制备过程3．单克隆抗体的优点能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备。4．单克隆抗体的应用(1)作为诊断试剂，具有准确、高效、简易、快速的优点。(2)用于治疗疾病和运载药物。基础诊断判断对错(正确的打“√”，错误的打“×”)1．动物细胞融合过程中既有细胞膜融合也有核的融合。(√)2．与植物原生质体融合相比，动物细胞融合特有的诱导因素有聚乙二醇、灭活的病毒。(×)提示：动物细胞融合特有的诱导因素为灭活的病毒。3．用特定的抗原对小鼠进行免疫后，从小鼠脾脏中只能得到一种B淋巴细胞。(×)提示：免疫后的小鼠从脾脏中获取的是多种B淋巴细胞。4．单克隆抗体是单个B淋巴细胞增殖并产生的抗体。(×)提示：单克隆抗体是杂交瘤细胞产生的抗体。5．单克隆抗体制备过程中的两次筛选目的相同。(×)提示：第一次筛选的目的是获得杂交瘤细胞，而第二次筛选是为了获得能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。核心突破动物细胞融合1．融合的原理与过程(1)原理：细胞膜的流动性。(2)过程：动物细胞融合的过程包括细胞膜融合、细胞质融合和细胞核融合。其中细胞膜融合是细胞融合的先导，在细胞膜融合中体现出细胞膜具有一定的流动性，细胞融合的实质是核融合。动物细胞融合完成的标志是两个或多个细胞核融合为一个细胞核。如下图(以灭活的病毒诱导为例)：2．融合的结果形成单核杂交细胞，具有原来两个或多个细胞的遗传信息，可表现出两个或多个亲本的特点。3．动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较比较项目植物体细胞杂交动物细胞融合原理细胞膜的流动性、细胞的全能性细胞膜的流动性、细胞的增殖融合前处理先除去细胞壁先使细胞分散开使用的酶纤维素酶和果胶酶胰蛋白酶或胶原蛋白酶诱导手段物理法：电融合法、离心法化学法：PEG融合法除物理法和化学法外，也可用灭活的病毒诱导过程结果杂种植株杂交细胞应用培育植物新品种主要用于制备单克隆抗体意义克服了远缘杂交不亲和的障碍，打破了生殖隔离，扩展了杂交的亲本组合合作探究：(1)什么是灭活？灭活病毒诱导融合的原理是什么？提示：灭活是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但是并不破坏这些病原体的抗原结构。灭活病毒诱导细胞融合的原理是病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。(2)动物细胞融合与植物原生质体融合的原理相同吗？提示：相同，都依据细胞膜的流动性。练习1．关于动物细胞融合的说法，不正确的是()A．动物细胞融合也称细胞杂交，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程B．动物细胞融合后形成的具有两个动物细胞遗传信息的单核细胞称为杂交细胞C．常用的诱导动物细胞融合的方法有聚乙二醇、灭活的病毒诱导、电激、紫外线照射等D．细胞融合技术突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能C[常用的诱导动物细胞融合的方法有物理法——离心、振动、电激等；化学法——聚乙二醇(PEG)诱导；生物法——灭活的病毒诱导。紫外线照射不是诱导动物细胞融合的方法。]2．下列关于动物细胞融合与植物体细胞杂交技术的说法，正确的是()A．基本原理相同B．诱导细胞融合的方法相同C．细胞融合前的处理过程相同D．融合后都需要进行筛选D[植物体细胞杂交的原理为细胞膜的流动性、植物细胞的全能性，而动物细胞融合利用的是细胞膜的流动性和细胞增殖；动物细胞融合常用灭活的病毒诱导，而植物体细胞杂交不能；动物细胞融合前需用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散开，植物体细胞杂交常用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁；诱导融合后会形成多种融合细胞，还有未融合细胞，因此要进行筛选。]单克隆抗体1．血清抗体与单克隆抗体的比较名称产生特点血清抗体由B淋巴(浆)细胞分泌一般从血清中分离，产量低、纯度低、特异性差单克隆抗体由杂交瘤细胞分泌特异性强、灵敏度高，能大量制备2.制备过程3．制备单克隆抗体过程中的两次筛选项目第一次筛选第二次筛选筛选原因诱导融合后得到多种杂交细胞，另外还有未融合的细胞从小鼠体内提取的B淋巴细胞有很多种，形成的杂交瘤细胞也有很多种筛选方法用特定的选择培养基筛选：未融合的细胞和同种细胞融合后形成的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长用多孔培养皿培养，在每个孔只有一个杂交瘤细胞的情况下开始克隆化培养和抗体检测，经多次筛选得到能产生特异性抗体的细胞群筛选目的得到杂交瘤细胞得到能分泌所需抗体的杂交瘤细胞4.单克隆抗体制备过程的关键分析(1)对动物免疫的原因：B淋巴细胞要经过免疫过程，即接触抗原，增殖分化为有特异性免疫功能的B淋巴细胞，才能产生相应的抗体，所以，与骨髓瘤细胞融合的B淋巴细胞实际上是浆细胞。(2)杂交瘤细胞具备双亲的遗传物质，不仅具有浆细胞产生特异性抗体的能力，还具有骨髓瘤细胞在体外培养条件下大量增殖的能力，从而可以克服单纯B淋巴细胞不能无限增殖的缺点，而大量生产单克隆抗体。合作探究：1.制备单克隆抗体的过程中的几种细胞，如免疫的B淋巴细胞、骨髓瘤细胞、杂交瘤细胞各有何特点？提示：免疫的B淋巴细胞：能产生单一抗体，但不能无限增殖；骨髓瘤细胞：能无限增殖，但不能产生抗体；杂交瘤细胞：既能产生特定的抗体，又能在组织培养条件下进行无限增殖。2．细胞内DNA的合成一般有两条途径，主要途径是在细胞内由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，而氨基喋呤可以阻断此途径。辅助途径是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情况下，经酶的催化作用合成DNA，而骨髓瘤细胞的DNA合成没有此辅助途径。如何利用DNA合成途径不同的特点配制培养基筛选出杂交瘤细胞？请说明原理。提示：在培养基中加氨基喋呤就可以筛选出杂交瘤细胞。因为培养基中加入氨基喋呤后，骨髓瘤细胞和两两融合的骨髓瘤细胞由于其唯一的DNA合成途径被抑制而不能增殖。B淋巴细胞本身不增殖，两两融合的B淋巴细胞也不增殖，只有杂交瘤细胞通过辅助途径合成DNA进行增殖。练习1．下列关于单克隆抗体制备的说法，正确的是()A．将特定抗原注射到小鼠体内，可以从小鼠血清中获得单克隆抗体B．经特定抗原免疫过的B淋巴细胞在体外培养时可分泌单克隆抗体C．诱导B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后，发生融合的细胞均为杂交瘤细胞D．筛选出杂交瘤细胞后，需利用特定抗原再次筛选分泌单克隆抗体的细胞D[制备单克隆抗体过程中，可在体外杂交瘤细胞的培养液中，或体内小鼠腹水中获得纯化的单克隆抗体，A错误；免疫过的B淋巴细胞高度分化，不能增殖，无法分泌单克隆抗体，B错误；发生融合的细胞可能有三种：B淋巴细胞－B淋巴细胞、B淋巴细胞－骨髓瘤细胞、骨髓瘤细胞－骨髓瘤细胞，C错误；制备单克隆抗体时，需筛选两次，第一次得到杂交瘤细胞，第二次得到既能无限增殖又能产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，D正确。]2．(不定项)下图为杂交瘤细胞制备示意图。骨髓瘤细胞由于缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT－)，在HAT筛选培养液中不能正常合成DNA，无法生长。下列叙述正确的是()A．可用灭活的仙台病毒诱导细胞融合B．两两融合的细胞都能在HAT培养液中生长C．杂交瘤细胞需进一步筛选才能用于生产D．细胞膜的流动性是细胞融合的基础ACD[诱导动物细胞融合的方法有电激、聚乙二醇、灭活的病毒(如灭活的仙台病毒)等，A正确；两两融合的细胞包括免疫B细胞与免疫B细胞融合的具有同种核的细胞、骨髓瘤细胞与骨髓瘤细胞融合的具有同种核的细胞、免疫B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交瘤细胞，骨髓瘤细胞虽然能无限增殖，但缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转移酶，免疫B细胞虽然有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶，但不具有无限增殖的本领，所以在HAT筛选培养液中，两两融合的具有同种核的细胞都无法生长，只有杂交瘤细胞才能生长，B错误；因每个免疫B细胞只分泌一种特异性抗体，因此在HAT筛选培养液中筛选出来的众多的杂交瘤细胞所分泌的抗体，不一定都是人类所需要的，还需要进一步把能分泌人类所需要抗体的杂交瘤细胞筛选出来，C正确；动物细胞融合是以细胞膜的流动性为基础的，D正确。][课堂小结]课堂检测1．动物细胞融合的原理是()A．细胞膜的流动性B．细胞膜的选择透过性C．细胞质的流动性D．细胞质酶的活性A[细胞能融合的原理是细胞膜具有流动性。]2．将小鼠的骨髓瘤细胞与一种免疫B淋巴细胞融合，融合后的细胞经培养产生单克隆抗体，其依据是()A．骨髓瘤细胞可以产生抗体，但不能无限增殖B．淋巴细胞只有与骨髓瘤细胞融合才能产生抗体C．骨髓瘤细胞可以无限增殖，且能产生抗体D．淋巴细胞可以产生抗体，但不能无限增殖，骨髓瘤细胞可以无限增殖D[B淋巴细胞能分泌抗体，但是在体外培养条件下，B淋巴细胞不能无限增殖，如果把一种B淋巴细胞与能在体外大量增殖的骨髓瘤细胞进行融合，所得到的融合细胞就能大量增殖，并产生足够数量的特定抗体，故选D。]3．在单克隆抗体制备过程中，对骨髓瘤细胞和B淋巴细胞诱导融合后，要用特定的选择培养基筛选出杂交瘤细胞。在这种培养基上不能存活、增殖的细胞是()①B淋巴细胞②骨髓瘤细胞③B淋巴细胞自身融合细胞④骨髓瘤细胞自身融合细胞⑤杂交瘤细胞A．①②③④B．①③⑤C．②④D．①③A[在题中所述特定的选择培养基上，能够存活、增殖的细胞只有杂交瘤细胞。]4．运用细胞工程技术获得单克隆抗体时，下列操作不必要的是()A．对小动物注射抗原B．融合并筛选杂交瘤细胞C．培养杂交瘤细胞D．将胰蛋白酶注入小鼠腹腔D[胰蛋白酶在动物细胞培养时用到，是加到培养基中用于分离细胞的。]5．下图表示单克隆抗体的制备过程，请据图回答下列问题：(1)据图可知，________________技术是动物细胞工程技术的基础，而________技术突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能。(2)图中过程①常用的诱导因素是________，过程②常在________培养基中完成。(3)A细胞为________细胞，其特点是_____________________。(4)合成的单克隆抗体最终可以从________和________中提取。[解析](1)动物细胞工程技术的基础是动物细胞培养，细胞融合技术突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能。(2)过程①中诱导细胞融合的方法很多，常用的主要有生物法，如用灭活的病毒，化学法，如用聚乙二醇(PEG)和物理法，如电激等。过程②是单克隆抗体技术的筛选过程，是在特定的选择性培养基上进行的。(3)A细胞为杂交瘤细胞，杂交瘤细胞具有既能迅速大量增殖，又能产生特定抗体的特点。(4)杂交瘤细胞的培养一般有体外培养和体内培养两种方式，体外培养是在液体培养基中培养，培养后从培养液中提取单克隆抗体；体内培养是在小鼠腹腔中培养，培养后从小鼠腹水中提取单克隆抗体。[答案](1)动物细胞培养细胞融合(2)灭活的病毒(或聚乙二醇)选择性(3)杂交瘤既能迅速大量增殖，又能产生特定抗体(4)培养液小鼠腹水