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实验十植物细胞微丝束的光学显微镜观察一、实验目的：1.掌握考马斯亮蓝R250染植物细胞质微丝的方法；2.对细胞内微丝的分布有一个整体上的认识。二、实验原理：细胞骨架(cytoskeleton)是指存在于真核细胞中的蛋白纤维网架体系，具有维持细胞形态结构和内部结构的有序性、参与细胞运动、物质运输、能量转换、信息传递和细胞分裂等重要功能。狭义的细胞骨架包括细胞质基质中微丝、微管和中间纤维。广义的细胞骨架还包括细胞核中的核骨架-核纤层体系。本实验主要观察洋葱细胞的微丝结构。微丝(microfilament,MF)，又称肌动蛋白纤维(actinfilament)，是由肌动蛋白(actin)亚单位组成的螺旋状纤维，直径为7nm，长度不定，多分布在近细胞膜的下方。在不同种类的细胞中，微丝又与某些结合蛋白一起形成不同的亚细胞结构，如张力纤维（stressfiber）、肌肉细丝、肠上皮绒毛轴心等。TritonX-100是一种非离子型表面活性剂(去污剂)，用适当浓度的TritonX-100处理细胞，能增加细胞膜通透性，将细胞膜和细胞质中的部分蛋白质和全部脂质溶解抽提出去而不破坏细胞骨架系统，从而使骨架图像更清晰便于观察。考马斯亮蓝R250是一种普通的蛋白质染料，可以使各种细胞骨架蛋白质着色，并非特异地显示微丝。M-缓冲液有稳定细胞骨架的作用，其中咪唑是缓冲剂，EGTA和EDTA螯合溶液中Ca2+离子，并提供Mg2+离子，在此低钙条件下，骨架纤维保持聚合状态并且较为舒张。三、实验仪器、材料和试剂：1.仪器：光学显微镜、烧杯、滴管、平皿、载玻片、盖玻片、镊子、刀片。2.材料：洋葱鳞茎细胞3.试剂：(1)0.01mol/L磷酸盐缓冲生物盐水(PBS)：0.2mol/LNa2HPO4/KH2PO4缓冲液(pH7.3)50mL，NaCl0.15mol/L，蒸馏水补至1000mL其中Na2HPO4/KH2PO4缓冲液(pH7.3)配法0.2mo1/LNa2HPO477mL，0.2mo1/LKH2PO423mL(2)M-缓冲液：咪唑(imidazole,pH6.7)50mmol/LKC150mmol/LMgCl20.5mmol/LEGTAlmmol/LEDTA0.lmmol/L巯基乙醇(mercaptoethanol)lmmol/L甘油4mmol/L用1mol/LHCl调pH至7.2。(3)1%的TritonX-l00/M-缓冲液(4)0.2%考马斯亮蓝R250染液，溶剂是:甲醇46.5ml+冰醋酸7ml+蒸馏水46.5ml(5)30%戊二醛-PB溶液，pH7.2四、实验内容与方法：1.撕取洋葱鳞茎内表皮若干片（约1cm2大小）；2.用PBS缓冲液浸泡10分钟，待之下沉；3.吸去缓冲液，用l%TritonX-l00/M-缓冲液处理30min，37℃。4.吸去TritonX-100，用M-缓冲液轻轻洗3次，每次10分钟，。5.3%戊二醛-PBS固定20min。6.PBS液洗3次，每次5-8分钟，用滤纸吸干。7.0.2%考马斯亮蓝R250染片20min，小心地用水漂洗至不再脱色。8.将表皮平铺在载玻片上，加盖玻片，置显微镜下观察。