色谱技术简介

色谱技术简介发布者：杭州科晓化工仪器设备有限公司发布时间：2007年1月30日Audolook6.0下载引言色谱法是1906年俄国植物学家MichaelTswett将含有有色的植物叶子色素和溶液通过装填有白垩粒子吸附剂的柱子，企图分离它们时而发现并命名的。各种色素以不同的速率通过柱子，从而彼此分开。分离开的色素形成不同的色带而易于区分，由此得名为色谱法（Chromatography），又称层析法。其后的一个重大进展是1941年Martin和Synge发现了液－液（分配）色谱法[Liquid-Lipuid（partition）Chromatography，简称LIC]。他们用覆盖于吸附剂表面的并与流动相不混溶的固定液来代替以前仅有的固体吸附剂。试样组分按照其溶解在两相之间分配。Martin和Synge因为这一工作而荣获1952年诺贝尔化学奖。在使用柱色谱的早期年代，可靠地鉴定小量的被分离物质是困难的，所以研究发展了纸色谱法（PaperChromatography，简称PC）。在这种“平面的”技术中，分离主要是通过滤纸上的分配来实现的。然后由于充分考虑了平面色谱法的优点而发展了薄层色谱法（Thin-LayerChromatography，简称TLC），在这种方法中，分离系在涂布于玻璃板或某些坚硬材料上的薄层吸附剂上进行。在Stah－l于1958年进行了经典性的工作将技术和所用材料加以标准化之后，薄层色谱法方赢得了声誉。为了帮助提高纸色谱法或薄层色谱法对离子化合物的分离效率，可以向纸或板施加电场。这种改进了方法分别称作纸上电泳或薄层电泳。新近发展起来的色谱法气相色谱法是Martin和James于1952年首先描述的，现已成为所有色谱法中最高级和最广泛使用的一种方法，它特别适用于气体混合物或挥发性液体和固体，即便对于很复杂的混合物，其分离时间也仅为几分钟左右，这已属司空见惯。高分辩率、分析迅速和检测灵敏等几种优点之综合使气相色谱法成了几乎每个化学实验室要采用的一种常规方法。近年来，因为新型液相色谱仪和新型柱填料的发展以及对色谱理论的更深入了解，又重新引起对密闭柱液相色谱法的兴趣。高效液相色谱法（High-PerformanceLiquidChromatography，简称HPLC）迅速成为与气相色谱法一样广泛使用的方法，对于迅速分离非挥发性的或热不稳定的试样来说，高效液相色谱法常常是更可取的。色谱法分类色谱法有多种类型，也有多种分类方法。（一）按两相所处的状态分类液体作为流动相，称为“液相色谱”（liquidchromatograp-hy）；用气体作为流动相，称为“气相色谱”（gaschromatogr-aphy）。固定相也有两种状态，以固体吸附剂作为固定相和以附载在固体上的液体作为固定相，所以层析法按两相所处的状态可以分为：液－固色谱（liquid-solidchromatography）液－液色谱（liquid-liquidchromatography）气－固色谱（gas-solidchromatography）气－液色谱（gas-liquidchromatography）（二）按层析过程的机理分类吸附层析（adsorptionchromatography）利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异，达到分离鉴定的目的。分配层析（partitionchromatography）利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数（或溶解度）不同，而使之分离的方法。离子交换层析（ion-exchangechromatography）利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同，而进行分离的方法。凝胶层析（gelchromatography）利用某些凝胶对于不同组分因分子大小不同而阻滞作用不同的差异，进行分离的技术。（三）按操作形式不同分类柱层析（columchromatography）将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。纸层析（paperchrmatography）用滤纸作液体的载体（担体support），点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定的目的。薄层层析（thinlayperchromatography）将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸层析类似的方法进行物质的分离和鉴定。吸附色谱法吸附色谱法常叫做液－固色谱法（Liquid-SolidChromatography，简称LSC），它是基于在溶质和用作固定固体吸附剂上的固定活性位点之间的相互作用。可以将吸附剂装填于柱中、覆盖于板上、或浸渍于多孔滤纸中。吸附剂是具有大表面积的活性多孔固体，例如硅胶、氧化铝和活性炭等。活性点位例如硅胶的表面硅烷醇，一般与待分离化合物的极性官能团相互作用。分子的非极性部分（例如烃）对分离只有较小影响，所以液－固色谱法十分适于分离不同种类的化合物（例如，分离醇类与芳香烃）。分配色谱法在分配色谱法（也称体液－液色谱法）中，溶质分子在两种不相混溶的液相即固定相和流动相之间按照它们的相对溶解度进行分配。固定相均匀地覆盖于惰性载体─多孔的或非多孔的固体细粒或多孔纸上（纸上谱）。为避免两相的混合，两种分配液体在极性上必须显著不同。若固定液是极性的（例如乙二醇），流动相是非极性的（例如乙烷），那么极性组分将较强烈的被保留。这是通常的操作方式。另一方面，若固定相是非极性的（例如癸烷），流动相是极性的（例如水），则极性组分易分配于流动相，从而洗脱得较快。后一种方法（它有相反的极性）称作为反相液─液色谱法。由于溶解度差别的细微效应，所以液─液色谱法很适于分离同系物的同分异构体。在液─液色谱法中，固定相几乎都被化学键合在载体物质上，而不是机械覆盖在它的表面。这种色谱法称作键合相色谱法（Bonded-PhaseChromatography，简称BPC）。这种方法的机理尚不清楚，可能是分配机理，也可能是吸附机理，视实验条件而定。高效液相色谱法中，键合相色谱法的应用远远超过所有其他模式。离子交换色谱法Sober和Peterson于1956年首次将离子交换基团结合到纤维素上，制成了离子交换纤维素，成功地应用于蛋白质的分离。从此使生物大分子的分级分离方法取得了迅速的发展。离子交换基团不但可结合到纤维上，还可结合到交联葡聚糖（S-ephadex）和琼脂糖凝胶（Sepharose）上。近年来离子交换色谱技术已经广泛应用于蛋白质、酶、核酸、肽、寡核苷酸、病毒、噬菌体和多糖的分离和纯化。它们的优点是:⑴具有开放性支持骨架，大分子可以自由进入和迅速扩散，故吸附容量大。⑵具有亲水性，对大分子的吸附不大牢固，用温和条件使可以洗脱，不致引起蛋白质变性或酶的失活。⑶多孔性，表面积大、交换容量大，回收率高，可用于分离和制备。一、基本理论离子交换剂通常是一种不溶性高分子化合物，如树脂，纤维素，葡聚糖，醇脂糖等，它的分子中含有可解离的基团，这些基因在水溶液中能与溶液中的其它阳离子或阴离子起交换作用。虽然交换反应都是平衡反应，但在层析柱上进行时，由于连续添加新的交换溶液，平衡不断按正方向进行，直至完全。因此可以把离子交换剂上的原子离子全部洗脱下来，同理，当一定量的溶液通过交换柱时，由于溶液中的离子不断被交换而波度逐减少，因此也可以全部被交换并吸附在树脂上。如果有两种以上的成分被交换吸着在离子交换剂上，用洗脱液洗脱时，在被洗脱的能力则决定于各自洗反应的平衡常数。蛋白质的离子交换过程有两个阶段──吸附和解吸附。吸附在离子交换剂上的蛋白质可以通过改变pH使吸附的蛋白质失去电荷而达到解离但更多的是通过增加离子强度，使加入的离子与蛋白质竞争离子交换剂上的电荷位置，使吸附的蛋白质与离子交换剂解开。不同蛋白质与离子交换剂之间形成电键数目不同，即亲和力大小有差异，因此只要选择适当的洗脱条件便可将混合物中的组分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的。二、离子交换的分类及常见种类（一）分类离子交换剂分为两大类，即阳离子交换剂和阴离子交换剂。各类交换剂根据其解离性大小，还可分为强、弱两种，即强酸剂阳离子交换剂弱酸剂强硷型阴离子交换剂弱硷型。1.阳离子交换剂阳离子交换剂中的可解离基因是磺酸（-SO3H）、磷酸（-PO3H2）、羧酸（COOH）和酚羟基（-OH）等酸性基。某些交换剂在交换时反应如下：强酸性：R-SO3-H+＋Na+R-SO3-Na+H+弱酸性：R-COOH＋Na+R-COONa＋H+国产树脂中强酸1×7（上海树脂＃732）和国外产品Dowex50、Zerolit225等都于强酸型离子交换剂。2.阴离子交换剂阴离子交换剂中的可解离基因是伯胺、（-NH2）、仲胺（-NHCH3）、叔胺[N-（CH3）2]和季胺[-N（CH3）2]等硷性基团。某些交换反应如下：强硷性：R-N+（CH3）2H·OH-＋ClR-N+（CH3）2Cl＋OH-弱硷性：R-N+（CH3）2H·OH-＋ClR-N+（CH3）2HCl＋OH-强硷性＃201号国产树脂和国外Dowex1、Dowex2、ZerolitFF等都属于强硷型阴离子交换剂。（二）种类1.纤维素离子交换剂：阳离子交换剂有羟甲基纤维素（CM-纤维素），阴离子交换剂有氯代三乙胺纤维纱（DESE-纤维素）。2.交联葡聚糖离子交换剂：是将交换基因连接到交联葡聚糖上制成的一类交换剂，因而既具有离子交换作用，又具有分子筛效应，是一类广泛应用的色谱分离物质。常用的Sephadex离子交换剂也有阴离子和阳离子交换剂两类。阴离子交换剂有DEAE-SephadexA-25，A-50和QAE-SephadexA25，A50；阳离子交换剂有CM-SephaetxC-50，C-50和SephadexC-25，C-50。阴离子交换剂用英文字头A，阳离子交换剂的英文字头是C。英文字后面的数字表示Sephadex型号。3.琼脂糖离子离交换剂：是将DESE-或CM-基团附着在SepharoseCL-6B上形成，DEAE-Sephades（阴离子）和CM-Sepharose（阳离子），具有硬度大，性质稳定，凝胶后的流速好，分离能力强等优点。三、实验操作（一）交换剂的处理，再生与转型新出厂的树脂是干树脂，要用水浸透使之充分吸水膨胀。因其含有政绩一些杂质，所要要用水、酸、硷洗涤。一般手续如下：新出厂干树脂用水浸泡2小时后减抽压去气泡，倾去水，再用大量无离子水洗至澄清，去水后加4倍量2NHCl搅抖4小时，除去酸液，水洗到中性，再加4倍量2NNaOH搅抖4小时，除硷液，水洗到中性备用。将树脂带上所希望的某种离子的操作称为转型。如希望阳树脂带Na+，则用4倍量NaOH搅拌浸泡2小时以上；如希望树脂带H+，可用HCl处理。阴树脂转型也同样，若希望带Cl-则用HCl，希望带OH-则用NaOH。用过的树脂使其恢复原状的方法称为再生。并非每次再一都用酸、硷液洗涤，往往只要转型处理就行了。（二）柱上操作⑴交换剂装柱最简单的交换层析柱可用硷式滴定管代替。处理过的树脂放入烧杯，加少量水边搅拌边倒入保持垂直的层析管中，使树脂缓慢沉降。交换剂在柱内必须分布均匀。⑵上样向层析柱内倾入样品液⑶洗脱与收集不同样品选用的洗脱液不同。原则是用一种比吸着物质更活泼的离子，把吸着物交换出来。由于被吸着的物质往往不是我们所要求的单一物质，因此除了正确选择洗脱液外还采控制流速和分布收集的方法来获得所需的单一物质。胶色谱法凝胶色谱技术是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛采用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。一、基本理论（一）分子筛效益一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时，各分子在柱内同时进行着两种不同的运动：垂直向下的移动和无定向的扩散运动。大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快。小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另