蛋白质定量7

第三章蛋白质的定性定量分析第一节蛋白质的含量测定第二节其它蛋白质定性定量分析技术第三节特定蛋白质含量的测定方法第四节蛋白质的分子量测定第五节等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点意义:蛋白质的定性定量分析技术是蛋白质结构与功能研究的重要基础工具。目的:蛋白质定性分析(qualitativeanalysis）的目的是确定在样品中是否存在蛋白质，存在的是什么蛋白分子。蛋白质定量分析（quantitativeanalysis）的目的是确定样品中总蛋白（totalprotein）的含量或者某种单一蛋白成分的含量。第一节蛋白质的含量测定目前蛋白质的直接定量分析技术只能测定样品中的总蛋白含量。到目前为止，尚没有任何一种方法能够直接分析蛋白样品中某种专一蛋白成分的含量，除非将其高度纯化或采用间接方法测定。主要的蛋白质定量方法可以归纳为三类：1.基于蛋白质的元素组成特点直接进行分析．如凯氏定氮法；2.在发现蛋白质的各种化学呈色反应基础上建立的各种比色法，如双缩眼法、Folin酚法、Lowry法、考马斯亮蓝染色法和BCA（二喹啉甲酸）法等等；3.基于蛋白质的光吸收特性的紫外光谱法。一、凯氏定氮法：该法是1883年丹麦化学家Kjeldahl建立的，后人在所用器材、定氮方法等方面均做过多次改良，使之在精确性、敏感性和操作的简便程度上不断改进，至今它仍然是蛋白质定量的最为精确和标准的方法。（一）原理：凯氏法是基于蛋白质的含氮量通常在16%左右这一特点的基础上而建立的，因此也称为凯氏定氮法（Kjeldahldetermination）。用凯氏蒸馏装置将氨收集到无几酸中，用标准碱溶液进行滴定确定氨量，根据氨量计算出样品的含氮量，进而计算出蛋白质的含量。（二）凯氏法的基本流程消化→蒸馏→滴定消化装置蒸馏装置（三）凯氏定氮法的优缺点1.优点：适用于一切形态的样品，无论是固体还是液体都可以获得精确的分析结果。尤其是当样品溶液浑浊时，用其他方法不能进行蛋白质含量分析。而采用凯氏定氮法仍能可以获得可靠的结果。2.缺点：样品中存在非蛋白氮对测定值有直接影响，测定前需除去；在构成蛋白质的氨基酸有偏差时，造成测定误差；操作过程繁琐，对操作者的技术熟练程度要求高。（四）凯氏定氮法用途测定范围在0.3-3μg蛋白质，由于凯氏定氮法是蛋白质的直接定量法，因此一直作为蛋白质的标准方法。凯氏定氮法在固体样品蛋白质分析中的应用仍然是其他方法所不能取代的，目前在农业及食品工业中，仍然作为动植物和食品蛋白质的含量测定法使用。二、双缩脲法测定蛋白质含量（1）原理：在碱性溶液中，双缩脲（H2N-CO-NH-CO-NH2）与二价铜离子作用，生成紫红色的络合物，这个反应称为双缩脲反应。凡是分子中含有两个及两个以上酰胺基团（-CO-NH2）或类似基团的任何化合物，均可发生双缩脲反应。蛋白质分子含有众多肽键（-CO-NH-），故可发生双缩脲反应，且呈色强度在一定范围内与肽键的数量即蛋白质含量成正比。λmax540nm双缩脲法测定卵清蛋白吸收光谱曲线00.10.20.30.4400500600700波长（nm）吸光值三、Lowry法是O.Lowry在1951年发表J.chem的一个在Folin酚试剂法和双缩脲法的基础上建立的蛋白质含量分析法，因此也称.Lowry改良法。（一）原理：涉及两步反应第一步：基于双缩脲测定法，即在碱性溶液中含有肽键的化合物可以与Cu++反应形成紫红色的络合物，其颜色的深浅与蛋白质的含量成正比。第二步：基于Folin酚试剂（磷钼酸和磷钨酸混合液）法中酚试剂与蛋白质中的芳香族氨基酸（色氨酸和酪氨酸）反应呈现深兰色的原理。深蓝色的鉬蓝和钨蓝混合物——测得A500值Folin酚试剂：甲试剂：碳酸钠氢氧化钠硫酸铜酒石酸钾纳（NaKC4H4O64H2O）乙试剂：磷钼酸磷钨酸硫酸溴（二）Lowry法优缺点1.优点：（1）具有与比色法的共同优点，即可对多个样品同时进行分析（2）灵敏度提高（比双缩脲法灵敏100倍），比紫外灵敏10-20倍，与凯氏法相当，操作简便。（3）结合双缩脲反应避免了酚试剂反应局限于色氨酸和酪氨酸所造成的蛋白质含量测定偏差。2.缺点（1）比色法要求保持光学透明度，因而对样品的溶解度要求高。（2）酚试剂在碱性溶液中的稳定性差易，导致误差。（3）反应易受多种物质干扰，如巯基化合物、糖类、钾离子、甘油、尿素、游离氨基酸和核酸类物质均干扰测定结果。（三）Lowry法用途测定范围为：1～15μg/mL。Lowry法目前仍是较常用的蛋白质定量分析方法，例如，我国在生物制品检查中规定，应采用Lowry法确定产品的蛋白质的含量。四、紫外光吸收法（一）原理：蛋白质在紫外区有两个吸收峰。一个吸收峰在280nm处，是由蛋白质中的芳香族氨基酸色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的苯环上的共扼双键引起的。其中色氨酸的光吸收最强．酪氨酸次之．苯丙氨酸较弱。大部分蛋白质中的芳香族氨基酸含量差别不是很大，故可以用溶液在280nm处的吸光度推算出蛋白含量。相对纯化的、无核酸污染的蛋白质的紫外吸收比值（A280/A260）约为1.8，如此值过低，表明有较多的的核酸杂质存在。蛋白质在紫外区的另一个吸收峰是由肽键造成的。蛋白质溶液在240nm以下时光密度急剧增加，215nm处的吸收率为280nm处的数倍。对含量很低的蛋白溶液可以用215nm处的光密度和225nm处的光密度之差来测定蛋白含量。蛋白质紫外吸收定量计算光吸收值A的Beer-Lambert公式:A=kcl=log(Io/I)=-logT,T(透过率,%)=I/Io;k,消光系数;c,摩尔浓度;l,样品池长度;I,光强度对混合蛋白质样品:1OD280nm≈1mg/ml对特定蛋白质的光吸收值的理论值:A280(1mg/mL)=(5690Nw+1280Ny+120Nc)/MNw,Ny和Nc分别为Trp,Tyr和Cys的数量,M为分子量;Scopes的经验公式:A2051mg/ml=27+120(A280/A205)蛋白质也可以下列经验公式定量:Proteinconcentration(ug/ml)=144(A215-A225)有核酸混入时,有三种近似计算法:Proteinconcentration(mg/ml)=1.55A280-0.76A260Proteinconcentration(mg/ml)=(A235-A280)/2.51Proteinconcentration(mg/ml)=0.813A230-0.0758A260（二）紫外光谱吸收法的优缺点1.优点：（1）紫外光谱吸收法最大的优点是简便，样品经稀释后，只需倒人比色杯测定光密度即可．其次是敏感度高。（2）另外一个特殊的优点是样品不损失，测定后可以继续使用。2.缺点：精确度差，其原因包括：①在同一紫外区有较强吸收的物质（核酸或某些缓冲液成分）强烈干扰测定结果；②不同蛋白质中芳香族氨基酸含量变动过大时，也会使在用280nm测定时结果出现较大偏差；③用215／225nm波长测定时散射光线干扰大．难以准确定量；④要求完全透明的蛋白质溶液。（三）紫外光谱吸收法的用途1.快速含量检测：紫外光谱吸收法主要用于蛋白质的快速含量检测，此时对蛋白质的定性需求高于准确定量需求。2.纯化过程中监测蛋白：最常用的是在蛋白质纯化过程中，尤其是各种色谱纯化过程中监测蛋白质的位置，判断吸附和洗脱情况。3.另外，对于一些准确度要求不高的蛋白质定量的实验，也可以用紫外光谱吸收法估测溶液中的蛋白质含量。用215/225nm波长测定的敏感度很高，所以在一些过于稀释的微量蛋白纯化过程中是一个十分有用的工具。（四）紫外光谱吸收法的操作取一定体积适当稀释的蛋白质溶液，放人石英比色杯内，在紫外分光光度计上读取相应波长处的光密度。光密度读数应该在0.1到0.8之间，低于或高于此范围都会产生较大的误差。1.做出标准曲线：用光密度读数计算溶液中蛋白质含量的方法有两种。一种是像一般比色法一样，同时读取一系列倍比稀释的已知蛋白含量的标准品溶液的紫外吸收光密度值，做出标准曲线，将样品与标准曲线相比即可计算出其蛋白质含量。2.不做标准曲线：直接根据溶液的A280/A260比值，用以下经验公式估算出蛋白质含量：蛋白质浓度(mg/ml)=1.45xA280－0.74x/A260（五）紫外光谱吸收法的注意事项1.用于仪器调零的液体要与待测样品一致，2.标准蛋白也需要使用同样的溶剂，以避免溶剂的紫外吸收特性干扰样品的测定五、考马斯亮蓝染色法考马斯亮蓝染色法是1976年由Bradfo等人建立的，因此也称为Bradford法。该法近年来在某些方面有取代经典的Lowry趋势，这是因为它操作简单、反应时间短。（一）原理考马斯亮蓝G-250在一定浓度的乙醇和酸性溶液中，呈现红色。在此溶液下，考马斯亮蓝G-250可以与蛋白质结合，并导致考马斯亮蓝G-250的颜色从红色变为兰色，最大吸收峰从465nm移至595nm。考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合的复合物在595nm波长处具有很高的光吸收，并与溶液中的蛋白质浓度呈正比。考马斯亮蓝G-250的结构：（二）考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的，但不适用于小分子碱性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。去污剂的浓度超过0．2％影响测定结果。如TritonX-100、SDS、NP-40等。1．Bradford浓染液的配制：将100rug考马斯亮蓝G-250溶于50m195％乙醇，加入100ml浓磷酸，然后，用蒸馏水补充至200ml，此染液放413至少6个月保持稳定。2．标准曲线蛋白质样本的准备：尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品，例如测定抗体，可用纯化的抗体作为标准。如果待测样本是未知的，也可用抗体作为标准蛋白。通常在20ug—150ug／100ul之间绘制标准曲线。3．将待测样本溶于100~1缓冲溶液中，该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同(最好用PBS)。4．按1：5用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，如出现沉淀，过滤除去。5．每个样本加5ml稀释的染料结合溶液，作用5～30rain。染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度。注意，显色反应不得超过30min．6．根据标准曲线计算待测样本的浓度。手上沾到了考马斯亮蓝？考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质通过范德华力结合，反应快速，并且稳定，无法用普通试剂洗掉。待一两周左右，皮屑细胞自然衰老脱落即可无碍。（三）考马斯亮蓝染色法的优缺点1.优点：操作简便；灵敏度高与Lowry法4倍；测定范围：10-100μg。考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合快，2min即可反应完全，生成的复合物颜色稳定1小时；对干扰剂不像Lowry法及紫外吸收法那样敏感。2.缺点：因染料与蛋白质的实际反应状况很复杂，色素与样的蛋白质不一定以化学当量相结合，有时会有非特异吸附的情况；要求样品完全溶解；样品不能回收使用。六、BCA(bicinchoninicacid)法FDA唯一认可BCA：二喹啉甲酸该检测法采用的是一种改进的Lowry法。第一步反应仍然是在碱性溶液中蛋白质与Cu2+反应形成络合物。第二步是BCA试剂与该络合物在562nm处的颜色反应。优点：操作简单，产物稳定，检测敏感性高。操作方法与上述的比色法类似．都需要在测定的同时制作标准曲线。缺点：仍然会受到一些物质，如含琉基试剂和去垢剂的干扰。表2－1汇总了几种蛋白质含量测定方法的部分特征数据，可根据样品的具体情况选用：第二节其他蛋白质定性定量分析技术我们介绍了样品中蛋白质的定量方法。虽然目前尚缺乏直接分析混合蛋白质样品中某种专一蛋白质的方法，但是已经有一些方法可以间接地对样品中蛋白质的种类、含量及翻译后修饰特性进行分析。如蛋白电泳染色分析、免