实验一培养基的制备

农业微生物实验课指导（修订版）草地农业科技学院草地保护研究所编写2012.09.01实验一培养基的制备一．实验目的明确培养基的配置原理。通过对基础培养基的配置，掌握配置培养基的一般方法和步骤。二．实验原理马铃薯葡萄糖琼脂培养基是一种半合成培养基，适宜于培养各种类型微生物，尤其适合培养真菌。这种培养基是由天然材料马铃薯和葡萄糖组成的，营养丰富而且原料容易取得，是一种使用而价廉的培养基。马铃薯浸出粉有助于各种微生物的生长，葡萄糖提供能源；琼脂是培养基的凝固剂。牛肉浸膏培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌培养基，有时又称普通培养基，由于这种培养基中含有一般细菌生长所需的最基本营养物质，所以可供作微生物生长繁殖之用。基础培养基中含有牛肉膏，蛋白胨和NaCl。其中，牛肉膏作为微生物碳源，能源，磷酸盐和维生素，蛋白胨提供氮源和维生素，而NaCl提供无机盐。在配置牛肉浸膏培养基时还需要加入一定量的琼脂作为凝固剂。高氏一号培养基是用来培养和观察放线菌形态特征的合成培养基。如果加入适量的抗菌药物，则可用来分离各种放线菌。此合成培养基的主要特点是含有多种化学成分已知的无机盐，这些无机盐可能相互作用而产生沉淀。因此，混合培养基成分时，一般是按配方的顺序依次溶解各成分，甚至有时还需要将两种或多种成分分别灭菌，使用时再按比例混合。三．实验准备实验材料：牛肉浸膏、蛋白胨、NaCl、琼脂、NaOH溶液、HCl(酸液)、葡萄糖、马铃薯(土豆)、酒精、可溶性淀粉2g、KNO30.1g、K2HPO40.05g，MgSO4·7H2O0.05g、NaCl0.05g、FeSO4·7H2O0.001g(母液)、琼脂2g、自来水100mL等。实验器材：高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、电炉、天平、三角瓶、纱布、线绳、记号笔、超净工作台、pH计、玻璃棒、量筒，烧杯和三角瓶等。四．实验步骤(1)PDA培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基的简称，即PotatoDextroseAgar。1、配方：马铃薯(去皮)200g、蔗糖15-20g、琼脂20-30g、蒸馏水1000mL。PH自然。2、步骤：(1)将马铃薯洗净，去皮，切成大小约为1-3cm的小块，称200g，放入1000mL水中煮沸20-30min，用四层纱布过滤，取其滤液；(2)定容：加水补足至1000mL；(3)加入称量好的蔗糖和琼脂至全部溶化；(4)趁热分装至试管或三角瓶；(5)用封口膜封口，扎紧，即可进行灭菌；(6)灭菌：将上述培养基以0.1Mpa，121℃，高压蒸汽灭菌20min，冷却后将培养基取出；(7)一般在培养基温度降至50-60摄氏度的时候开始在超净工作台上往培养皿中分装；(8)待培养皿中的培养基凝固后，将培养皿倒置，防止皿盖上的冷凝水污染培养基(此时皿盖在下，培养基中蒸发出的水蒸气是向上走的，还是凝结于培养基上，就不会有在皿盖上形成水滴后再滴落的情况了，如此可防止污染)。(2)牛肉膏蛋白胨琼脂培养基1、配方：牛肉膏3-5g、蛋白胨10g、氯化钠5g、琼脂20-30g、蒸馏水1000mL。PH值7.4-7.6。2、步骤：(1)称量：根据用量按比例依次称取各种成分，牛肉膏常用玻璃棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水融化后到入烧杯，蛋白胨易吸湿，称量时要迅速。(2)溶解：在烧杯中加入少于所需的水量，加热，逐一加入各成分，使其溶解，琼脂在溶液煮沸后加入，融化过程需不断搅拌。加热时应注意火力，勿使培养基烧焦或溢出。溶好后，补足所需水分。(3)调pH值：若pH值不适宜，可用1mol/LNaOH或1mol/LHCl把pH值调至所需范围。(4)过滤：趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利于某些实验结果的观察，如无特殊要求时可省去此步骤。(5)分装：按照实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角瓶内；分装高度以试管高度的1/4左右为宜，分装三角瓶的量则根据需要而定，一般以不超过三角瓶容积的1/2为宜。以下步骤同上(5)-(8)(3)高氏培养基：高氏培养基是用来培养和观察放线菌形态特征的合成培养基。1.配方可溶性淀粉(20g)、KNO3(1g)、K2HPO4(0.5g)、MgSO4·7H2O(0.5g)、NaCl(0.5g)、FeSO4·7H2O(0.01g)、琼脂20g、pH=7.4-7.6。2、步骤：配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入少于所需水量的沸水中，在火上加热，边搅拌边依次逐一溶化其他成分，溶化后，补足水分到100mL，调pH，121℃灭菌20min。高温灭菌后，倒平皿前加入10%酚2滴至100mL培养皿中混匀，将培养基倒入平皿内约15mL/皿。实验二环境中微生物的分离和培养一、实验目的1、消毒和灭菌的操作方法及原理。2、证明实验室环境与体表存在微生物。3、学习空气、土壤、实验室中微生物分离的方法。4、观察不同类群微生物的菌落形态特征。二、实验原理微生物在自然界中呈混杂状态存在，要获得所需菌种，必须从中进行分离。在保藏菌种时不慎污染时也需予以分离。分离纯化方法很多，基本原理相似，即将待分离样品进行适当的稀释，使微生物的细胞(或孢子)尽量以分散状态存在，然后使其长成一个个纯种单菌落。土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此，土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离纯化得到许多有价值的菌株。三、实验准备实验材料：PDA培养基(上一次实验课已准备)实验器材：天平、酒精灯、培养皿、三角瓶、试管、移液管、培养箱、记号笔、无菌水、超净工作台、棉花、酒精、拨针、接种环、手术刀和镊子等。四、实验步骤(一)消毒和灭菌(1)无菌滤纸的干热灭菌(暂时不做该部分)在160℃下，烘2小时。开始灭菌时升温不宜过猛，物品不要太挤，温度上升至160℃时开始计时，2小时后切断电源，温度降至60℃左右后，取出灭菌物品。(2)接种针、镊子等的高温火焰灭菌在95%酒精中浸过后，通过火焰将酒精烧去，重复三次以上。(3)紫外线用于空气消毒波长在250-280nm的紫外线杀菌力最强，30瓦紫外光灯直射2m内照射半小时，即可杀死空气中的微生物。打开紫外灯，灭菌30min。(4)化学药品用于种子及植物表面消毒次氯酸钠消毒：种子用1%，植物器官用0.3%消毒各1min。再用无菌水漂洗3-5次。(二)环境中微生物的检测1.器材PDA培养基(上一次实验课已备)，无菌镊子，无菌棉球等2.实验步骤：(1)取5个倒好培养基的培养皿作为对照;(2)取3个PDA培养基，打开皿盖，使培养基暴露在空气中约10min，再盖上皿盖，写明处理、组别和日期；(3)取3个PDA培养基，用无菌镊子夹上无菌棉球在实验台或凳子上擦以下，然后打开皿盖用棉球在培养基表面轻轻涂抹(勿划破培养基)，写明处理、组别和日期再盖上皿盖；(4)取3个PDA培养基，打开皿盖用你的手指在培养基表面接触轻压3-5点，再盖上皿盖。写明处理、组别和日期；(5)取取3个PDA培养基，打开皿盖，对着培养基表面咳嗽或打喷嚏2-3次(或者深呼吸)，再盖上皿盖。写明处理、组别和日期；(6)上述工作完备后，将各皿倒置保存在28℃下，培养3-6天。3天后进行初次统计，7天后，进行再次统计。五、思考题1.反复练习消毒和灭菌，并搞清楚其本质的区别。2.统计结果并做表，完成以下表格的内容环境/人体菌落数(个/皿)菌落特征(形状、颜色、大小、隆起度、边缘等)实验三病原微生物的分离和培养一、实验目的1、熟练掌握无菌操作技术和消毒、灭菌的操作步骤及其原理2、掌握植物病原真菌的分离、培养和接种的一般方法，并掌握其基本原理二、实验原理自然界中各种微生物混杂生活在一起，要研究某种微生物的特性，首先须使该微生物处于纯培养状态。从混杂的微生物群体中获得只含有某一株微生物的过程称，即为微生物的分离与纯化。植物病原微生物的分离培养对病原物鉴定、病原物形态观察、植物病害接种体的培养等方面都是经常使用的研究手段。植物患病组织内的微生物，如果给予适宜的环境条件，除个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。植物病原微生物的分离就是指通过人工培养，从染病植物组织中将病原真微生物与其它微生物相分开，并从寄主植物中分离出来，再将分离到的病原微生物于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病微生物的分离培养。植物病原真微生物的分离一般都是采用组织分离法，就是切取小块病组织，经表面消毒和灭菌水洗过后，移到人工培养基上培养。三、实验准备实验材料：植物病株(校园中红豆草褐秆病)、种子(苜蓿、红豆草、沙打旺)、土样(校园红豆草地中)，培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基PDA供分离真菌，牛肉胨培养基NA供分离细菌)。实验工具：无菌培养皿、三角瓶、玻璃刮刀、吸管、手术刀、镊子、酒精灯、无菌滤纸、酒精灯，剪刀，小烧杯，大烧杯和记号笔等。实验试剂：无菌水，75%酒精、0.1%NaClO溶液。四、实验步骤(一)准备工作1.工作环境的清洁和消毒在无菌室、无菌箱或无菌工作台(超净工作台)上进行。超净工作台要经过紫外线照射(30min)并用药物消毒(70%酒精喷雾)。2.分离材料的选择选择新近发病的植株、器官或组织作为分离材料，可以减少腐生菌的污染。任何植株坏死部分的内部或表面，都可能有腐生物的寄生，所以一般斑点病要从病斑边缘的组织剪取，即从病、健组织交界处获得分离材料，将感病组织洗净后放入试管或培养皿内。图1：新鲜植物病株示意图(二)植物病原真菌的分离1.PDA培养基的制备2.冲洗病叶，从病斑周围1-2mm处剪取。3.取灭菌的小烧杯或培养皿，放入组织材料，先用70%酒精溶液处理30-60秒，再用0.3%次氯酸钠溶液处理1-3分钟。4.消毒后，取出，用无菌水冲洗3-5次。5.用灭菌镊、剪在无菌条件下将分离材料剪成2-3mm大小的方块，每块组织均为病健相间的组织。用灭菌镊子夹取剪好的材料，加入培养基平板上轻轻按压，每皿4-5块，排放均匀。6.用记号笔在培养皿上注明分离的代号、日期、姓名，将培养皿倒转置于22-25℃的培养箱中培养。7.3-4天后，挑选由分离材料上长出的典型而无杂菌的菌落，在菌落边缘用菌针挑取带有菌丝的培养基一小块转入斜面试管培养基中央，或有培养基的培养皿中央，于25℃培养箱中培养。图2：病原真菌在培养皿中的分离培养情况(三)土壤细菌的分离1.制作土壤稀释液：准确称取土样10g，加入装有90mL无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，振荡约20min，使土样与水充分混匀。用一支无菌吸管从中吸取1mL土壤悬液加入装有9mL无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液1mL，移入装有9mL无菌水的试管中，也吹吸三次，即成l0-3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、等一系列土壤稀释液。2.涂布：将无菌平板编上10-4、10-5、10-6号码，每一号码设置至少三个重复，用无菌移液管按无菌操作要求吸取10-6稀释液各1mL放入编号10-6的3个平板中，同法吸取10-5稀释液各lmL放入编号10-5的3个平板中，再吸取10-4稀释液各lmL放入编号10-4的3个平板中(由低浓度向高浓度时，吸管可不必更换)。再用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂抹均匀，每个稀释度用一个灭菌玻璃涂棒，更换稀释度时需将玻璃涂棒灼烧灭菌。在由低浓度向高浓度涂抹时，也可以不更换涂棒。3.培养：至于恒温培养箱中培养。图3.：制备土壤稀释液(分级稀释)图4：平板划线法分离平板划线法分离的方法1.斜线法2.曲线法3.方格法4.放射法5.四格法图5：划线法得到的培养物3.培养(28℃)4.分离菌种统计，计算每种菌在土壤中的数量(多少菌落/克土壤)5.菌种纯化(24h后)6.菌种保藏(留作鉴定)(四)菌种的纯化1.菌落边缘切取法：选择典型菌落，用灭菌的接种环切取边缘菌丝或孢子移植到斜面或平板上培养，可以获得纯培养菌种。2.PDA平板表面单孢子挑取法：将需要纯化的菌种在无菌玻片上水滴中悬浮开，再用接种环划线到平板上，继而在显微镜下挑选单孢子移植培养。图6：真菌孢子示意图五、思考题1.试拟出从土