碱性磷酸酶标记方法

碱性磷酸酶标记方法(戊二醛两部法)将100uL碱性磷酸酯酶加入到300uL10mMPBS（pH7.2），再加入40uL25%的戊二醛，混匀，4摄氏度活化20小时；透析至10mMPBS（pH7.2），24小时，换液4次；将目的蛋白用10mMPBS（pH7.2）配成4mg/mL；将125uL目的蛋白加入活化过的碱性磷酸酶中（终浓度为5000UAP/mg蛋白），混匀，4摄氏度反应24小时。参考文献：A蛋白碱性磷酸醋酶的标记及酶联测试EnzymeLinkedImmunosorbentAssayUsingAlkalinePhosphataseConjugatedwithStreptococcalProteinG使用200mgAP/mg蛋白2.5mgAP（50IU/mg），加入200uL含1.25%戊二醛的100mM的PB（pH6.8），混匀，室温反应过夜；4摄氏度条件下，电磁搅动，透析至50mMPBS（pH7.2），12小时，换液4次；1.5mg目的蛋白溶于100uL1M的CB（pH9.5）；将活化的AP加入配好的蛋白质液体中，混匀，4摄氏度条件下反应24小时；加入10uL200mM的赖氨酸溶液，混匀，22摄氏度条件下反应2小时；4摄氏度条件下透析至50mMPBS（pH7.2），12小时，换液4次；离心，取上清，用50mMTB7.4+0.6%BSA+0.05%NaN3稀释10倍，-20摄氏度保存。底物缓冲液：100mMTB9.0+100mMNaCl+1mMMgCl2参考文献：碱性磷酸酶标记链霉亲和素2．戊二醛交联标记法：此法是以双功能交联剂为桥，使酶与抗体(抗原)结合。最常用的交联剂是戊二醛。它具有两个活性醛基，可分别与酶分子和抗体(抗原)分子上的氨基结合。戊二醛法又根据试剂加入的方法分为一步法和二步法。一步法将抗体(抗原)、酶和戊二醛同时混合。此法操作简便，广泛用于；HRP、AP与抗体(抗原)的交联。但酶标记物的产率低，由于结合物立体构型障碍，酶和抗体容易失活；酶和抗体易发生自身交联，影响标记效果。二步法先将过量的戊二醛与酶反应，让酶分子上的氨基仅与戊二醛分子上的醛基结合，不发生酶与酶的结合，除去未与酶结合的多余戊二醛后，再加入抗体(抗原)，形成酶—戊二醛—抗体(抗原)结合物。其优点是酶标记物均一，无自身聚合，分子量小易穿透细胞膜，灵敏度与活性均较高，但其产率更低。戊二醛标记法：酶结合量(mg／ml)=OD403X0.4IgG含量(mg／m1)=（OD280－OD403X0.42）X0.94X0.62过碘酸钠标记法IgG含量(mg／m1)＝(OD280－OD403X0.3)X0.62。计算克分子比或摩尔比(E／P)HRP／IgG＝HRP(mg／m1)／HRP分子量÷IgG(mg／m1)／IgG分子量=HRP(mg／m1)／40000÷IgG(mg／m1)／160000＝HRP(mg／m1)／IgG(mg／m1)X4(E／P)一般为l一2。酶的标记率：二结合物中酶量／标记时的酶量X100％(或酶的标记率=OD403／OD280)一般酶量为lmg／ml、HRP／IgG在1.5—2.0之间、酶的标记率大于0.3。