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附件3：湖南省中医药科研计划项目申请书上册（任务书）课题名称：二甲双胍联合滋肾活血汤对2型糖尿病大鼠CRP、TNF-a的影响的实验研究课题类别：一般项目承担单位：湖南中医药大学课题负责人：颜国富联系手机：13607306636课题申请时间：2011.4.18湖南省中医药管理局填写说明一、请用A4纸打印，页面不敷可另加页。二、所有栏目应如实填写，确无填写内容请填“无”。三、课题研究周期一般设计为二年，最长不超过四年。共同条款签约各方应共同遵守以下条款：一、湖南省中医药管理局为甲方，课题牵头单位为乙方，牵头单位所在市州卫生行政部门或省部直单位为丙方。二、任务执行过程中，乙丙方如需变更任务书内容，应向甲方提出书面说明，经批准后实施。在未接到正式批准前，乙丙方须按原任务书履行，否则，后果由乙丙双方负责。三、本任务书为下达湖南省中医药管理局科技计划项目使用，甲丙方对课题研究有监督权、处置权。乙方因主、客观原因不能按任务书约定内容执行时，甲方有权终止任务，乙方应偿还已投入的全部经费。四、本任务书由签约方各持一份。一、基本情况研究课题名称二甲双胍联合滋肾活血汤对2型糖尿病大鼠CRP、TNF-a的影响的实验研究所属学科生物与医药研究工作总经费3万研究工作起止年月2011.6—2013.6预期成果本课题成果预期达到国内领先水平，尤其在糖尿病专业领域采用中药预防与治疗糖尿病血管并发症方面起到指导性作用。课题组主要成员序号姓名身份证号职称学历所在单位课题中分工签名1颜国富430602196211240016教授本科湖南中医药大学附属岳阳医院全面负责指导课题全过程的设计实施2胡仙430181198008101382主治医师硕士湖南中医药大学附属岳阳医院具体设计实施方案与资料总结3李淑君430103196901231546教授硕士湖南中医药大学附属岳阳医院具体设计实施方案与资料总结4冯佩430621198410250469医师硕士湖南中医药大学附属岳阳医院实施设计方案5承担单位序号单位名称地址及联系电话1湖南中医药大学附属岳阳医院岳阳市枫桥湖路269号23二、研究目标本研究基于多年临床经验和前期大量基础研究工作，旨在进一步寻求以中西医结合为主，具有良好价效比，适合中国国情的治疗和预防糖尿病血管病变的有效方药。为了进一步探讨该方的作用机制，特设计此实验以深入研究，也为其将来的开发提供科学试验依据。三、主要研究内容和技术方案一．研究内容1.糖尿病血管病变早期阶段病理改变的内在机制研究。2.中药对于糖尿病血管病变的预防和治疗作用效果评估。3.中药对于糖尿病血管病变的预防和治疗作用的机理研究。4.中药预防和治疗糖尿病多系统作用途径研究。5.评价中药和化学药物对于糖尿病血管病变的早期预防和治疗的效果差异。6.中西医结合对于糖尿病血管病变的预防和治疗作用效果评估。7.筛选预防和治疗糖尿病血管病变有确切作用效果的中药二、技术方案、拟采取的研究方法、技术路线和实验方案1.实验对象：清洁级近交系雌性Wister大鼠42只，6月龄，重约150g-200g，由湖南省中医药大学动物实验中心提供。2.实验材料饲料及饲养环境：空白对照组常规饮食，造模组喂给高糖高脂高胆固醇饲料。此饲料由本院实验动物中心自配，其中含10%蔗糖，10%猪油，2.5%胆固醇。每笼10只，自由摄食、饮水。室温18-22°C，空气流通，相对湿度55-70%，12小时光照维持，昼夜循环。药品及试剂：滋肾活血汤为湖南省中医药大学附属岳阳医院中药房一次性购买。二甲双胍：北京嘉德制药有限公司生产。实验试剂NO试剂盒碧云天生物技术研究所INS放免试剂盒北京北方生物技术研究所TNF-α放免试剂盒北京北方生物技术研究所ET放免试剂盒北京北方生物技术研究所SABC免疫组化试剂盒博士德生物工程有限公司浓缩型DAB显色试剂盒博士德生物工程有限公司主要仪器：BIOMIAS图像分析系统：湖南中医药大学基础研究院日本尼泰克ACE919型全自动生化分析仪。法国S-500P半自动生化分析仪。光镜:OLYMPUSBX50日本产电镜:日本JEM-1010（HC）100KV高衬度透射电子显微镜3.实验方法：造模方法：造模组高糖高脂高胆固醇饲料喂养2个月后，禁食12小时，断尾取血，血糖值为16.7mmol/l-25mmol/l者入选。造模成功后，各组恢复常规饮食。分组方法：动物购回，适应性喂养一周后，随机分成空白对照组、模型对照组、中药组、二甲双胍组、中药+二甲双胍组（n=6），除空白对照组外，其他动物均用于造模。造模后，选择符合模型标准的大鼠分别随机分组如下：模型对照组、中药组、二甲双胍组、中药+二甲双胍组，各组数量保持相等，每组均为6只。给药方法：从造模成功后的第一天开始给药，疗程为8周。灌胃情况如下：○1中药组：每日灌胃量相当于临床成人用药量的10倍，即6ml/kg，每日1次，共8周；○2二甲双胍组：每日灌胃量相当于临床成人用药量的10倍，即6ml/kg，每日1次，共8周；○3中药+二甲双胍组：每日灌胃量相当于临床成人用药量的10倍，即6ml/kg，每日2次，共8周；○4模型对照组：每日灌胃量相当于临床成人用药量的10倍，即6ml/kg，每日1次，共8周；○5空白对照组：每日灌相当于临床成人用药量的10倍的生理盐水，即6ml/kg，每日1次，共8周；测试指标及取材动物给药8周后，处死前12h禁食，股动脉取血约4～5ml，其中1.5ml于EDTA+抑肽酶的抗凝试管内，用做ET的检测。余血放置于试管内，离心取血清，备做NO、INS、TNF-α、TG、BUN、CREA、UA的检测。立即取胰腺、肝脏、肾脏病理切片：HE染色；股动脉、腹主动脉病理切片：MASSON染色4.统计方法：所有数据均采用SPSS统计软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（x±S）表示。两样本均数比较采用成组t检验（One-SampleTTest），多样本均数的两两比较采用单因素方差分析（one-wayANOVA）。以P＜0.05作为有显著性差异。5.技术路线：（附图于后）实验开始前，随机抽取6只大鼠作为空白组对照组，并立即断头处死，取血标本测定生化指标。然后迅速剥离取出双侧髂股动脉、腹主动脉、胰腺、肾脏用生理盐水冲洗，10%福尔马林原位固定24h，常规制片，动脉用MASSON染色，内脏用HE染色，做光镜、电镜检查。造模成功后，选取成模大鼠，随机分成模型对照组、中药组、二甲双胍组、中药+二甲双胍组。除模型对照组外，余组均给药。治疗8周后，将全部大鼠处死，收集上述生化、放免及病理切片等各项指标。各组为6只算入统计，认真详细记录所有数据。技术路线附图如下：34只大鼠喂高糖高脂高胆固醇饲料（10%蔗糖，10%猪油，2.5%胆固醇），共8周。购入清洁级Wistar大鼠40只，适应性喂养1周。取6只断头处死作为空白对照组取血生化指标：FPG、TG、HDL、TC。取肝、胰、肾、股动脉、腹主动脉做病理切片，准备光镜和电镜检查。8周后取6只大鼠做上述指标中药+二甲双胍组组C3模型对照组中药组二甲双胍组用药8周后各组分别处死，测所有指标。统计指标，评估标本，发表论文，实验结束。四、实施计划和考核指标工作起止年月研究内容考核指标经费预算（万元）2012年1月-2012年3月检索资料，开题2012年4月-2012年6月购买大鼠、联系实验室，准备预试验2012年7月-2012年9月统计数据，初评实验2012年10月-2012年12月正式实验2013年1月-2013年3月扫尾工作，形态学观察。2013年4月-2013年6月相关指标检测2013年7月-2013年9月数据收集，汇总分析2013年10月-2013年12月统计数据，总结课题，发表文章，申请成果鉴定。其他说明注：时间安排以3个月为单位填写。五、经费预算分类细目科目细目规格数量单价经费预算（元）备注实验材料费试剂药品、动物采购、耗材Wistar大鼠预实验10只+正式实验40只350.9万小型专用仪器设备费实验观察和资料收集仪器购买费用0.4万业务费资料查新和收集0.1万协作费科研协作费、设备租赁使用费0.4万差旅费管理费参加会议和科研协作，管理和协调0.2万经费合计2万六、签约一、甲方：湖南省中医药管理局同意将本课题列为湖南省中医药科研计划项目。课题资助金额：万元课题编号：科技主管：湖南省中医药管理局（盖章）年月日二、乙方：课题牵头单位匹配研究经费：万元课题组第一负责人：财务负责人：开户名、行及帐号：同意按任务书约定内容执行。科技主管：单位（盖章）年月日其他单位科技主管：单位（盖章）其他单位科技主管：单位（盖章）三、丙方：课题牵头单位所在市州卫生行政部门（或省部直单位等）同意按要求进行日常管理。科技主管：单位（盖章）年月日注：请在详细了解共同条款之后签署。湖南省中医药科研计划项目申请书下册课题名称：二甲双胍联合滋肾活血汤对2型糖尿病大鼠CRP、TNF-a的影响的实验研究申请时间：2011-4-22湖南省中医药管理局一、研究本课题的科学依据（包括本领域研究现状、水平、发展趋势、存在问题、本课题特色、创新之处等）随着人们生活水平的提高和生活方式的改变，糖尿病患病率逐年增加。根据国际糖尿病联盟(InternationalDiabetesFederationIDF)统计，目前全球有糖尿病患者2．33亿，预计到2025年全球将有3．80亿人罹患糖尿病。糖尿病可导致多种大血管及微血管病变，其中心血管疾病、脑血管疾病以及糖尿病肾病为糖尿病患者的主要死亡原因。近年来，糖尿病与炎症的关系备受关注，有学者提出，糖尿病是一种炎症性疾病，诸多炎症因子与糖尿病及糖尿病并发症发生与发展密切相关。糖尿病患者在血糖升高的同时，体内炎症因子如C一反应蛋白(CRP)、肿瘤坏死因子-a(TNF—a)、白细胞介素6(IL一6)等也明显升高。近年研究表明，胰岛素抵抗、肥胖、高血压患者血清炎症因子包括C一反应蛋白(CRP)、肿瘤坏死因子一a(TNF--a)、白细胞介素一6(IL一6)、血浆纤溶酶原激活物抑制因子一l(PAJ一1)等升高。炎症反应与糖尿病的发生发展以及血管并发症的关系受到关注，目前认为2型糖尿病可能是细胞因子介导的炎症反应，是一种免疫性疾病，炎症在糖尿病的发病机制中起媒介作用【1】。因此，在控制糖尿病患者血糖的同时，应该设法减轻患者体内的慢性炎症反应，尤其需要降低循环中CRP等代表机体炎症反应的指标，以改变糖尿病及其慢性血管并发症的进程，延缓动脉粥样硬化的发生与发展。CRP是由肝脏产生的一种急性期反应蛋白。在正常人体含量甚微，急性炎症阶段可迅速升高，是临床上最有效的炎症标志物。近年来多项研究结果提示，体内CRP水平升高可能参与了IR和胰岛β细胞的损害。CRP主要受血循环IL-6、TNF-α调节，尤其IL-6是促进肝脏合成CRP的主要炎症因子,反过来CRP也可以刺激单核细胞释放IL-6、IL-1、TNF-α介导内皮细胞产生单核细胞趋化蛋白-1和内皮细胞黏附分子等,发挥致炎作用。TNF-α是一种主要由单核E巨噬细胞产生的具有广泛生物活性的细胞因子，可诱导IL-6、IL-1、CRP的合成。TNF-α通过多种途径导致糖尿病的发生：（1）直接作用于胰岛β细胞，生成环磷酸鸟苷，损伤细胞DNA；（2）与其他细胞因子协同作用，诱导NO的形成,并抑制葡萄糖诱导的胰岛素分泌；（3）抑制胰岛素受体和胰岛素受体底物1（IRS-1）的酪氨酸残基磷酸化,影响胰岛素信号传导；（4）抑制葡萄糖转运因子4（GLUT4）基因转录,并使GLUT4mRNA降解加速；（5）激活IKK进而促进TNF-α转录，形成低度炎症的正反馈环，加重IR；（6）抑制其他脂肪细胞因子如脂联素的合成及增加游离脂肪酸的释放等。近年来炎症学说备受关注，认为糖尿病是一种自然免疫和低度炎症性疾病，炎症在2型糖尿病的发病机制中起媒介作用。炎症反应程度的高低和2型糖尿病中糖、脂代谢紊乱以及后期各种并发症的出现关系密切。炎症学说的提出为糖尿病的发病机制、探讨防治的新方法和开发新药物提供了一个新的研究方向。英国前瞻性糖尿病研究证实，