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核磁共振实验技术1•一、NMR技术的起源与发展•二、液体NMR谱仪的基本结构和对样品的要求•三、NMR实验技术、方法、特点和选择•四、实验技术的新进展及其应用2核磁共振实验技术NMR技术的起源与发展（一）、核磁共振的起源•1896年法国物理学家贝克勒尔发现，铀和含铀的矿物能够发出看不见的射线，这种射线可以穿透黑纸使照相底片感光。•1921年斯特恩－革拉赫实验（德国，银原子），并通过它观测到十分微弱的核磁矩。证实了原子在磁场中不能任意取向，原子磁矩在磁场中只能取2J+1个分立数值，J为总角动量量子数。是第一次观察到原子磁矩取向量子化的实验。1943年斯特恩NobelPrize物理。•1924年奥地利学者Pauli提出了NMR的基本理论：原子核磁矩与自旋的概念。•1937年拉瑟里尤(B.G.Lasarew)和舒伯尼科(L.W.Schubnikow)对固态氢开展了研究，并用传统的方法测出氢的核磁矩值，拉瑟里尤和舒伯尼科被认为是最早发现核磁现象的人。•1939年IsidorIsaacRabi使氢分子先后通过不均匀磁场和均匀磁场，同时用一射频信号照射均匀磁场中的分子束，在某一确定频率处就会吸收射频能量而发生细小但可测量的偏转。核磁共振现象的首次观察。1944年获得NobelPrize物理。•1946年斯坦福大学的布洛赫(FelixBloch)和哈佛大学的珀塞尔(EdwardPurcell)。在主磁场的垂直方向上对进动的原子核进行激发可使其进动角度增大;停止激发后原子核又会恢复至激发前的状态，并发射出与激发电磁波同频率的射频信号。这一现象被称为核磁共振（技术的应用）。1952年获得NobelPrize物理学奖。3NMR技术的起源与发展4（二）、现代核磁共振技术的发展1966年瑞士物理化学家RichardErnst研制出脉冲傅利叶技术,大幅提高了灵敏度。脉冲傅利叶变换核磁共振谱、二维核磁共振谱。核磁谱学。1991年NobelPrize化学。2002瑞士科学家库尔特.维特里希Wüthrich，多维NMR波谱学在测定溶液中蛋白质结构的三维构象。NobelPrize化学。2003年美国科学家Lauterbur和英国科学家Mansfield，磁共振成象(magneticresonanceimaging,MRI)技术领域的突破性成就,NobelPrize生理和医学。5NMR技术的起源与发展（三）、核磁谱仪的发展1946-1952布洛赫便和珀塞尔一起研制出世界上第一台核磁共振谱仪。1953年，第一台商品谱仪问世。美国Varian公司，30Hz,7000高斯，0.7特斯拉1964年，美国Varian公司，超导磁场核磁谱仪，200MHz,4.74特斯拉。1969年，美国Varian公司，第一台傅里叶变换核磁谱仪，100MHz,2.35特斯拉。1977年，美国Damadian，第一台人体核磁共振断层成像仪（CT）1979年，德国Bruker公司，第一台500MHz超导核磁谱仪。2000年，美国Varian公司，第一台900MHz超导核磁谱仪。目前有8台仪器：2台600MHz、3台500MHz、2台400MHz、1台300MHz(停用）。7NMR技术的起源与发展（三）、核磁谱仪的发展从最初的NMR谱仪，经历了三次大的革命，不同类型的NMR波谱仪，可按不同的方式进行分类：1.按激发和接收方式可分为：连续波发射分时发射脉冲发射谱仪2.按磁体的性质分为：永磁电磁超导磁体谱仪连续波永磁谱仪结构简单操作，但由于灵敏度太低，80年代已淘汰了。70年代初发展了电磁体NMR谱仪使磁场强度一直加大，高时可达100兆，磁体重2.7吨，而且耗电量也很大。随着超导技术、电子技术和计算机技术的发展，脉冲傅里叶变换高分辨超导NMR仪在近二十年来发展很快。场强由88年的600兆，94年的750兆，98年的800兆至2000年10月900兆。现在已有1000兆高场谱仪上市。8NMR技术的起源与发展（三）、核磁谱仪的发展从NMR实验技术看经历了四个过程:a、一维1H谱，连续波检测小分子结构。b、脉冲傅里叶变换实验，检测1H，13C和一些多核谱图，如31P，15N等等（场强较高下完成）。c、二维、三维和多维谱的发展随着超导磁体的引入，计算机及电子技术的进一步发展，使得二维和多维核磁共振技术在80年代末，90年代初发展很快，各种多脉冲实验层出不穷，NMR技术变得更完善，更多样化和更具有针对性的分析研究样品。d、梯度场的发展脉冲梯度场技术是90年代初用于NMR谱仪分析研究的，一经应用于NMR分析，其优点很快的体现出来了，如利用梯度脉冲探头可以在3分钟之内测试一个H-HCOSY。大家知道匀场是做好NMR谱图的关键，也是每个NMR操作者的基本功，以前为了匀场有时需要几十分钟或更长时间，现在只需40多秒。9NMR技术的起源与发展（四）、NMR技术的应用迄今为止，比较完善的NMR技术广泛的应用于化学、医学、生物学，药理学，生物化学和药物学等领域，应用之广是很难全面概括的，正因为如此，1991年诺贝尔化学奖授予了瑞士苏黎世联邦理工学院的NMR专家R.R.Ernst教授，这不仅是对Ernst教授为核磁共振的发展作出杰出贡献的表彰，也是对核磁共振在化学领域和其它学科发挥重要作用的肯定。很少有一项技术多次获得诺贝尔奖，从该技术应用分类，主要有以下几类：a、医学和医学功能成像研究在医院主要用于疾病的诊断（MRI）场强一般在100兆-200兆以内。近年来，NMR成像的应用领域不断扩大，研究对象遍及人体，动物、植物、矿物以及各种天然或人工合成材料，并逐渐形成了不同的分支学科，成像仪也逐渐发展成适合于不同用途和不同研究对象的各类专用成像系统，如功能成像所用场强最高的达到9个特斯拉(Ts)。b、固体NMR研究主要研究无机物、化工多聚物和高分子材料等方面的研究工作。c、液体核磁的应用研究分子结构和分子运动等现象，确定化合物结构。药物代谢产物和代谢组学的研究。10NMR技术的起源与发展NMR发展的里程碑YearDevelopmentNature1970FTNMRInstrumental1975SuperconductingmagnetsInstrumental19802DNMRMethodological1985ProteinstructuredeterminationMethodological1990Isotopelabeling/multidimensionalNMRMethodological1990PulsedfieldgradientsInstrumental/Methodological1995NMRscreeningMethodological1997TROSYMethodological1998LC-NMR/LCMS-NMRInstrumental2000CryoprobesInstrumental11NMR技术的起源与发展•三、核磁谱仪的发展从仪器的种类上大致分为三类：1.液体核磁2.固体核磁3.核磁共振成像武汉牛津-中科二、液体NMR谱仪的基本结构和对样品的要求1314什么是核磁共振？电磁辐射跃迁及波谱技术波长范围电磁辐射光区光子能量/eV(电子伏)能级跃迁类型波谱技术高能辐射区10-4~10-2nmγ射线区2.5✕105原子核内部能级跃迁Mössbauer10-2~10nmX射线区2.5✕105~1.2✕102核内层电子能级跃迁电子能谱中能辐射区100~400nm紫外光区1.2✕102~3.1核外层电子能级跃迁紫外光谱400~800nm可见光区3.1~1.7核外层电子能级跃迁可见光谱2.5~25µm红外光区1.7~1.2✕10-4分子振动-转动能级跃迁红外光谱低能辐射区0.1~50cm微波区1.2✕10-4~1.2✕10-7电子自旋能级跃迁纯转动光谱电子顺磁共振谱50~500cm射频区1.2✕10-6~1.2✕10-9核自旋能级跃迁核磁共振谱核磁实验室仪器的布局和注意事项16液体NMR谱仪的基本结构液体核磁共振谱仪主要部件的功能19超导核磁共振谱仪磁体构造Principlesofasuperconductingmagnet超导核磁共振谱仪磁体超导核磁共振谱仪磁体构造不同磁场强度下仪器分辨率的比较SensitivitiesDecasaccharid(zgpr,NS=64)800MHz600MHz400MHzSignal/Noiseratio(forH1(Man-4'))1680:11130:1594:1不同磁场强度下仪器灵敏度的比较信噪比磁场强度与分辨率和灵敏度的关系分辨率核磁共振的基本原理：∆E=γhB0/2π∆E:原子核跃迁能量差；γ:旋磁比；h：普朗克常数；B0:磁场强度∆E=hƲ➟Ʋ=γB0/2πB0⬆︎,Ʋ⬆同一质子在不同频率（400or600）的谱仪下有相同的化学位移化学位移δ(ppm)=Ʋ样品－ƲTMS(TSP)(以Hz为单位)/B0（仪器的频率,以Hz为单位）Ʋ样品(400MHz)=δ样品*B400MHz；Ʋ样品(600MHz)=δ样品*B600MHzƲ样品(600MHz)Ʋ样品(400MHz),分辨率600MHzV样品400MHz,24？为什么磁场强度越强谱图的分辨和灵敏度就越好1500Hz/300MHz=5ppm2000Hz/400MHz=5ppm2500Hz/500MHz=5ppm3000Hz/600MHz=5ppm仪器的兆周数谱仪的分辨率26磁场强度与分辨率和灵敏度的关系灵敏度核磁共振的基本原理：∆E=γhB0/2π∆E:原子核跃迁能量差；γ:旋磁比；B0:磁场强度∆E越大，原子核吸收和发射的能量就越大，特别是原子核自身发射的能量，其值越大检测器越容易检测到，因而灵敏度就越高。S/N∝m•γ3,m:原子核和数目（丰度）总之，磁体的磁场（B0）越强，NMR谱仪的分辨和灵敏度就越高。另外，γ越大的原子核其分辨和灵敏度也越高。例如：γ13C=6.728×107Rad•S-1•T-1γ1H=26.753×107Rad•S-1•T-1γ1H/γ13C≈4仅仅是γ，1H的灵敏度就是13C的43=64倍，同时1H的天然丰度是13C的100倍，因此1H的灵敏度是13C的6400倍，所以13C谱图的获得需要更长时间的累加,1H几分钟。磁感应的强度的表示方式是特斯拉T,or高斯Gs1Gs=10T；T:周期;Hz:频率，1MHz=106Hz;T=1/HzƲH=γHB0/2π=26.753×107×B0/2×3.1427超导核磁共振谱仪磁体原子核基础共振频率ƲH（MHz）磁体强度B0（T）1H3007.041H4009.41H50011.71H60014.11H80018.8常见核磁共振谱仪器的分类（MHz）是以1H在不同磁体下的基础共振频率的兆周数进行划分的。？核磁共振谱仪是怎么划分为300MHz、400MHz、500MHz、600MHz、800MHz的探头磁体的功能是产生一个恒定的磁场。探头则置于静磁场之中，用于激发检测核并探测核磁共振信号。核磁共振技术的一个弱点就是其灵敏度最少比光谱低4个数量级，这主要是核磁共振的能量低，导致核磁场下上下两个能级的布局数差异过小所致（400兆核磁强度下上下两个能级之间布居数（能量差）差为10万分之3）。提高检测灵敏度一直是NMR所追求的目标，磁场强度的增强是一个最有效的方法，∆E=γhB0/2π。但是磁场强度增强的成本太高，因此相比之下，对探头功能的开发改造成为一个更加可行的方法。当前市场上常见的探头类型有双核探头,四核探头,宽带探头,低频探头,低温探头,微量探头,固体探头,成像探头等。通常一台核磁共振波谱仪可以配备多个探头，按照不同的测试目的,随时进行探头更换。此外，根据杂核线圈和氢核线圈在探头内的位置不同，探头还可以分为正向探头（杂核在内，碳谱灵敏度高）和反向探头（氢核在内，氢谱灵敏度高）。理论上,一台核磁谱仪应该同时配备正向与反向探头,遇到进行正向或反向实验时可以分别更换使用,从而得到最佳的检测效果。现在部分NMR生产商具有2合1探头，